PflhDCSTM碱基突变对其在大肠杆菌中转录活性的影响

摘要

细菌鞭毛的生物合成，组装和旋转需要大量的资源和能量，为了避免不必要的能量消耗，鞭毛进化出了一套高度有序的表达调控系统，其中flhDC基因是整个鞭毛系统的主调控基因。flhDC基因受多种环境因素的调控，有一系列的正调控或负调控因子调控flhDC基因的表达。为研究flhDC基因的表达调控，实验室前期从鼠伤寒沙门氏菌CVCC542中扩增了不同长度的flhDC基因启动子片段（pflhDCSTM），本研究首先将不同长度pflhDCSTM克隆于含lacZ报告基因的载体中，转化至沙门氏菌CVCC542和大肠杆菌JM109感受态细胞，采用β-半乳糖苷酶试验测定不同长度pflhDCSTM在CVCC542和JM109菌株中的转录活性，结果发现pflhDCSTM在CVCC542和JM109菌株中具有相似的转录活性。为进一步研究pflhDCSTM在JM109菌株中的转录调控，本研究采用易错PCR的方法对pflhDCSTM引入随机突变，并将突变的pflhDCSTM克隆于报告载体中，转化至JM109感受态，获得含突变pflhDCSTM的JM109重组菌株。然后结合β-半乳糖苷酶试验筛选活性升高的克隆，并对这些克隆进行测序，获得了这些高活性克隆的碱基突变位点。此外，本研究还通过人工定点突变，对其中部分突变位点进行了验证，证实了-200和-242处的点突变会导致pflhDCSTM在大肠杆菌中转录活性的升高。
　　综上，本研究获得了一系列能够使pflhDCSTM在大肠杆菌中转录活性升高的碱基突变位点，为研究flhDC基因的表达调控和探索flhDC基因的转录因子提供了一定的基础。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 细菌鞭毛的表达调控

1．2 易错PCR

1．3 β-半乳糖苷酶

1．4 重叠延伸产生人工定点突变

2 PflhDCSTM碱基突变对其在大肠杆菌中转录活性的影响

2．1 材料

2．1．1 质粒与菌株

2．1．2 试剂及工具酶

2．1．3 培养基

2．2 方法

2．2．1 实验所用的引物及设计

2．2．1 不同长度flhDC启动子片段于CVCC542和JM109菌株中转录活性的测定

2．2．2 含不同长度5’-UTR flhDC基因的JM109重组菌的动力试验

2．2．3 flhDC启动子区域随机点突变的引入

2．2．4 β-半乳糖苷酶试验筛选转录活性增高的突变PflhDC片段

2．2．5 人工定点突变验证高活性突变位点

2．3 结果

2．3．2 含不同长度5’-UTR flhDC全长基因的JM109重组菌动力试验结果

2．3．3 flhDC启动子区域随机点突变的引入

2．3．4 高活性突变克隆菌落PCR检测结果

2．3．5 高活性突变flhDC启动子片段测序结果分析

2．3．6 PCR引入人工定点突变结果

2．4 讨论

参考文献

附录

攻读硕士阶段的研究成果