猪链球菌2型丝氨酸/苏氨酸去磷酸酶Stp1与Stp2生物学功能比较

摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）是猪链球菌35个血清型中主要的流行血清型，人兽共患，临床上能引起人和猪的脑膜炎、关节炎及败血症。我国先后于1998年和2005年暴发了两次SS2感染人的事件，不仅使养猪业经济损失重大，还对人类健康造成威胁，引发人群公共卫生安全问题。
　　蛋白质磷酸化是细胞信号转导系统的核心，其中激酶与磷酸酶分别介导磷酸化与去磷酸化过程，调控相关蛋白的功能和细胞生命活动的进行，丝氨酸/苏氨酸(Serine/threonine)的磷酸化与去磷酸化作用对细胞的生长代谢至关重要。原核生物的Stks(Serine/threonine kinases)和Stps(Serine/threonine phosphatases)能够通过对靶蛋白进行翻译后修饰进行调控，即细菌可以通过Stks磷酸化和Stps去磷酸化作用，改变底物蛋白的构象或性质，调节其活性和功能，或间接调控下游靶基因的表达，以适应在不同环境中的生存。
　　SS2中有两个编码Stp的基因stp1和stp2，本研究旨在:(1)比较SS2去磷酸酶Stp1与Stp2酶学特性差异;(2)探究stp1与stp2基因缺失对SS2致病性的影响。
　　1.重组Stp1与Stp2酶学特性比较
　　通过体外原核表达与纯化，获得SS2的重组Stp1和Stp2蛋白，采用经典pNPP试验，比较了磷酸酶Stp1与Stp2的酶学特性。通过试验优化获得Stp1与Stp2的最适反应条件，包括最适金属离子种类、离子浓度、反应pH以及温度，并在最适条件下进一步测定并比较两者的酶活。结果表明:Stp1具Mn2+依赖性，在1.0mM Mn2+、pH8.0和37℃时有最大反应活性;而Stp2为Mn2+或Mg2+依赖性，在μM级Mn2+、pH7.0-8.0和25-60℃时均有较高活性。Stp1酶动力学参数Km值为25.43±6.61mM，Vmax值为44.84±4.86μM/min;Stp2Km值为13.94±3.90mM，Vmax值为120.8±13.94μM/min。酶的比活力Stp1为2.25IU/mg，Stp2达24.16IU/mg，Stp2的活性高于Stp1。
　　2.猪链球菌2型stp1与stp2基因功能比较分析
　　利用同源重组法成功构建SS2基因缺失株Δstp1、Δstp2和Δstp1-stp2，分别进行生长、氧化应激、溶血、细胞黏附、细胞毒性与小鼠致病性试验，比较分析Stp1与Stp2可能参与的生物学过程。结果显示:与亲本株相比，Δstp1和Δstp1-stp2的生物学特性相似，即stp1缺失后细菌易于成链，单个菌体变长变大，抗氧化应激能力增强(P＜0.01)，溶血活性、Hep-2细胞黏附能力及致上皮细胞毒性作用增强（P＜0.01），对小鼠的致病性下降(P＜0.01)。而Δstp2与亲本株相比，其对生长、溶血、细胞黏附作用不明显，对小鼠致病力有一定程度下降（差异不显著），可能与其在细菌中的表达量较低有关。
　　综上所述，虽然Stp2的体外酶活性显著强于Stp1，但对细菌的抗氧化应激、溶血、黏附、小鼠致病力等方面起作用的是Stp1，提示Stp1在SS2感染与致病性中起主要作用。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

第一章 猪链球菌研究进展

1．猪链球菌概述

2．毒力相关因子在致病机制中的作用

3．磷酸化系统

4．本研究的目的及意义

第二部分 试验研究

第二章 猪链球菌2型Stp1与Stp2酶学比较

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第三章 猪链球菌2型stp1与stp2基因缺失株构建

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第四章 猪链球菌2型Stp1与Stp2生物学功能比较

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

全文总结

展望

参考文献

作者简历

致谢