DVDMS多级靶脂质体介导的声动力治疗在脑胶质瘤中的应用

摘要

研究目的： 声动力治疗作为一种新的肿瘤治疗方法已引起越来越多的关注。然而，声敏剂难于穿过血脑屏障、无法颅内示踪以及无影像引导的超声激励限制了其在脑肿瘤上的应用。研究表明，iRGD能协助药物穿透血脑屏障并靶向肿瘤内递送：卟啉及其衍生物可以与金属离子鳌合形成金属卟啉。基于此，本次研究拟将声敏剂华卟啉钠与锰离子鳌合获得锰-卟啉，进而构建iRGD靶向载锰-华卟啉脂质体，利用iRGD的作用实现声敏剂在脑胶质瘤中的靶向渗透，借助磁共振成像观察其在肿瘤中的聚集，并引导超声定点激励声敏剂，以期达到精准声动力治疗脑胶质瘤的目的。所获得结论可为研究iRGD靶向载锰-华卟啉脂质体磁共振影像引导声动力治疗颅内瘤的效果、生物安全性及其相关机制提供相关思路，为声动力治疗肿瘤以及其他疾病提供新的思路和方法。 研究方法及结果： 第一部分：Mn-华卟啉钠靶向脂质体的制备与表征 本研究利用DVDMS的化学结构中H离子可被Mn离子代替形成卟啉类金属化合物的特性将其鳌合成DVDMS-Mn纳米颗粒。并选择标准PEG化脂质体和iRGD化脂质体作为DVDMS-Mn纳米颗粒的载药平台。 结果表明：①通过氮吹薄膜水化法制得粒径为LP-DVDMS、LP、iRGDLP粒径分别为：96±2.26nm、106±2.32nm、110±2.6nm。并通过透射电镜、马尔文Nano-ZS90型动态光散射粒径分析仪、MRI对三种脂质体进行表征分析。②在Lp、iRGDLP脂质体最终脂质体中DVDMS∶Mn的比例约1∶2。 第二部分：计算Mn-华卟啉钠靶向脂质体包封率方法 利用紫外分光光度法测定各种脂质体中华卟啉钠的载药浓度，利用电感耦合等离子体光谱仪ICP测定脂质体中Mn2+的浓度。两者比例进行评估，判定脂质体中DVDMS∶Mn的真实鳌合比例。 结果表明：①LP-DVDMS、LP、iRGDLP三者的包封率分别为：65％、73％、71％。②在Lp、iRGDLP脂质体最终脂质体中DVDMS-Mn的比例为1∶1.98。 第三部分：Mn-华卟啉钠靶向脂质体细胞内的抗肿瘤效应研究 将实验分为六组：Control组、US only组、LP、iRGDLP、LP+US、iRGDLP+US。Control组不做处理;US only组不做药物孵育处理，仅以1W、10％占空比的聚焦探头超声作用1min;LP组仅以2μm的LP脂质体与细胞孵育8小时，不做超声处理;iRGDLP组以2μm的iRGDLP脂质体与细胞孵育8小时，不做超声处理。LP+US组以2μm的LP脂质体与细胞孵育8小时，然后用1W、10％占空比的聚焦探头超声作用1min;iRGDLP+US组以2μm的iRGDLP脂质体与细胞孵育8小时，然后用1W、10％占空比的聚焦探头超声作用1min;建立细胞瘤球模型。然后得出：①LP、iRGDLP组分别为53nm、102nm。在相同时间内其渗透深度是Lp组的1.84倍。②在有超声作用时，LP、IRGDLP两组均能产生ROS，且靶向肽iRGDLP组产生的荧光强度要比普通脂质体LP组多，杀死细胞能力更强。 第四部分：Mn-华卟啉钠靶向脂质体活体内的抗肿瘤效应研究 首先成功建立小鼠颅内原位瘤模型，然后将荷瘤小鼠按照肿瘤大小平均分为六组每组5只：Control组、US only组、LP、iRGDLP、LP+US、iRGDLP+US。Control：每只老鼠仅注射生理盐水200μ1;LP组：每只老鼠经尾静脉注射0.02μmolLP脂质体，不进行超声治疗;iRGDLP组：每只老鼠经尾静脉注射0.02μmol iRGD-LP-DVDMS-Mn，不进行超声治疗;单纯US组：每只老鼠仅注射生理盐水200μl，在第2h、8h时进行超声辐射，频率为1MHz，10％的duty，每次1min;LP+US组：每只老鼠经尾静脉注射0.02μmol LP-DVDMS-Mn，在药物注射后仅第2h、8h时进行超声辐射，频率为1MHz，10％的duty，每次1min;iRGDLP+US组：每只老鼠经尾静脉注射0.02μmol iRGD-LP-DVDMS-Mn，在药物注射后仅第2h、8h时进行超声辐射，频率为1MHz，10％的duty，每次1min。 结果显示：①Control、LP、iRGDLP、US、LP+US、IRGDLP+US各组经流式细胞仪检测各组的凋亡比例分别为2.3％、7.1％、9.5％、3.7％、14.4％、20％。②颅内荧光检测在第17、20天时，iRGDLP+US组肿瘤大小约为Control的1/4-1/3大小。（③超声对肿瘤增长有所影响，超声可以稍微减缓肿瘤的增长速率，iRGDLP+US组生存期超40天，对肿瘤生长抑制作用更强。 研究结论： 1、体外实验：制备的iRGDLP具备DVDMS-Mn核，是一种具有声敏性质的既能磁共振成像效果又能具有T1增强的独特优势。 2、细胞层面，iRGDLP组能够更多的聚集于肿瘤细胞中，且相比DVDMS有更高的安全性。iRGDLP+US组具有高度肿瘤杀伤作用。 3、瘤球层面，iRGDLP组在瘤球模型中有绝对的靶向优势（平均浸润深度：iRGDLP组为102nm，LP组为53nm）。 4、动物实验中，iRGDLP+US组对颅内肿瘤生长抑制作用更强（对照LP组、iRGDLP组、LP+US组）、iRGDLP+US组小鼠的生存期更长。 5、不同处理组心、肝、脾、肺、肾的HE染色表示未进行超声作用的部位，脂质体对其损伤非常小。肿瘤部位流式细胞检测显示iRGDLP+US组的凋亡占比更高，肿瘤的杀伤作用更大。

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致谢

摘要

缩略语表

前言

第一部分脂质体的制备与表征

1．1实验仪器与试剂

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4讨论

1．5 小结

第二部分建立脂质体携载华卟啉钠效率的测定方法

2．1材料与仪器

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5小结

第三部分DVDMS、LP、IRGDLP在C6细胞中的摄取以及杀伤情况

3．1材料和仪器

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5小结

第四部分靶向华卟啉钠脂质体体内抗肿瘤效应研究

4．1实验仪器与试剂

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

声动力治疗实现条件的研究现状

作者简历及在学期间所取得的科研成果