声敏剂Sonoflora介导的声动力治疗小鼠S180肉瘤实验研究

摘要

背景：恶性肿瘤已成为危害人类健康和生命的主要疾病之一。据目前最新调查结果显示:我国肿瘤引起的死亡率在所有疾病病因中居第2位(占17.9％)，并且发病率呈上升趋势。如何诊治肿瘤是目前医学界的重大难题之一，继传统的手术、化疗及放疗等治疗方式之后，肿瘤的分子靶向治疗在现代肿瘤治疗模式中产生了划时代的意义。然而，目前研发的靶向药物虽然副作用较小，但只对部分具有特异性靶点的肿瘤疗效好，而大部分肿瘤患者的获益率低。因此，寻找靶向性好、副作用小、总体人群有效率高的恶性肿瘤治疗新方法，是肿瘤界面临的重大课题。声动力学疗法(Sonodynamic therapy，SDT)是在光动力学疗法（Photodynamic therapy，PDT）的基础上发展起来的一种肿瘤治疗新理念，是通过静脉注射或口服声敏剂，声敏剂通过血流靶向性在肿瘤组织中聚集，然后利用低强度的超声照射肿瘤，以声能激活声敏剂，使其在肿瘤局部产生一系列理化反应（如声致发热、单线态氧、羟自由基等），导致肿瘤细胞不可逆性损伤，而达到抗肿瘤治疗的一种新手段。SDT将超声深部无创穿透能力及精确定位能力与声敏剂对肿瘤组织的靶向性相结合，确保了对表浅及深部的各种肿痛靶向性治疗。因其无创性和靶向性成为肿瘤治疗的一种新方法，有着广阔的发展前景。但是既往使用的声敏剂多为血卟啉的衍生物（如HPD、PhotofrinⅡ），存在声动力效应差、靶向性不高、排泄缓慢，易发生光敏反应等问题。虽以叶绿素为原料合成的新型声敏剂如二氢卟吩e4、二氢卟吩e6，克服了血卟啉衍生物的缺点，但国内无知识产权，进口价格昂贵，亦限制了其在声动力治疗领域的应用。我们以光合作用强、毒副作用小的叶绿素为原始合成原料，通过计算机模拟分子结构改造、修饰等过程，在叶绿素卟啉母体上引入两个特定的长链型氨基酸基团作为接收声波的“天线”，合成新型声敏剂Sonoflora。目前Sonoflora的生物学效应、毒理实验及光声谱性质已被验证;但声敏剂在肿瘤细胞及组织的靶向性聚集、抗肿瘤作用以及安全性，仍未开展。本实验将通过采用激光共聚焦实验、肿瘤抑制试验、血常规生化检验等方法验证声敏剂在小鼠S180肉瘤模型中靶向聚集性、抗肿瘤效应、毒副反应等;为最终挑选出高效、低毒且具有自主知识产权的新型声敏剂奠定实验基础，并将推动声动力治疗在临床肿痛靶向性治疗领域的发展及应用，具有重大的理论意义、社会效益和经济效益。
　　 目的：本研究的第一个目的是采用用共聚焦显微镜观测Sonoflora在小鼠S180肉瘤模型中肿瘤靶向聚集性，探索给药后最佳的超声辐射时间。第二个目的是研究Sonoflora联合超声对S180肉瘤的杀伤作用，探索最佳的声动力治疗模式。第三个目的是研究观察Sonoflora（10、20、40 mg/kg）腹腔注射后3h～72h对S180肉瘤荷瘤小鼠血常规、生化指标的影响，判断其安全性。
　　 方法：⑴S180肉瘤细胞株在小鼠腹腔传代7次，待细胞株生长稳定后，取腹腔传代第8天的S180肉瘤细胞悬液，加无菌生理盐水，调节细胞浓度为1×107个/ml。去除小鼠右侧腋毛，取0.2ml细胞悬液接种于小鼠右腋皮下。腋下接种7天后，电了游标卡尺测得肿瘤平均直径约0.7cm后用于实验。⑵选取肿瘤大小均一，体重相近的荷瘤小鼠35只，随机分7组，每组5只。在暗室内腹腔注射Sonoflora10mg/Kg，避光避声饲养，分别于注射后3、6、12、18、24、48、72h断颈处死荷瘤小鼠，剥离肿瘤和正常肌肉组织，制备冰冻切片，并在激光共聚焦显微镜下观测肿瘤和肌肉组织的荧光显像及荧光强度（显示为红色荧光）。⑶选取肿瘤大小均一，体重相近的荷瘤小鼠50只，随机分组，每组5只小鼠。(1)对照组(C):腹腔注射无菌生理盐水组;(2)单纯超声组:声强分别设定为0.4W/cm2(U1)、0.8W/cm2(U2)、1.6W/cm2(U3);(3)单纯Sonoflora组:浓度分别设定为10mg/kg(S1)、20mg/kg(S2)、40mg/kg(S3);(4)超声+Sonoflora组:Sonoflora浓度定为10 mg/kg，声强分别设定为0.4W/cm2(S1U1)、0.8W/cm2(S1U2)、1.6W/cm2(S1U3)。在暗室内腹腔注射Sonoflora，避光避声饲养，声敏剂注射18h后进行超声处理，超声辐照时间固定为180s。每2天用电子游标卡尺测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。计算肿瘤体积公式:肿瘤体积=π/6[（长径+宽径）/2]3。15天后脱颈处死小鼠，剥离肿瘤组织，电子天平称重，比较瘤体重量。⑷选取肿瘤大小均一，体重相近的荷瘤小鼠140只，随机分4大组:对照组(C);腹腔注射Sonoflora10mg/kg组;20mg/kg组;40mg/kg组。每大组35只荷瘤小鼠，再随机分为7组，每小组5只老鼠。避光避声饲养，并分别于给药后3、6、12、18、24、48、72h，采用摘眼球取血法取血，放入EDTA血常规管，取血液约1.5 ml混匀后在2h内给予送检检验科，检测血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、直接胆红素、肌酐、尿素氮、乳酸脱氢酶、磷酸肌酸。⑸统计方法:实验数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，两组之间比较采用t检验，多组之间比较采用one-way ANOVA方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：①腹腔注射后3h后，Sonoflora（10mg/kg）在肿瘤组织中含量开始显著高于正常肌肉组织(P＜0.05)，持续至48h。其中18h时Sonoflora在肿瘤和正常肌肉组织含量均达最高峰，且此时差异最明显，肿瘤组织荧光强度是正常肌肉组织的5.33倍。72h后肿瘤及正常肌肉组织荧光均明显减弱甚至消失。鉴于18h肿瘤组织声敏剂含量与正常肌肉含量之比最大，此时若对肿瘤进行辐照处理，既可有效的杀伤肿瘤细胞，又对周围正常组织损伤较小，我们选用这一时间点进行声动力实验。②单独应用超声或Sonoflora对肿瘤生长的影响通过对各组小鼠肿瘤体积的生长趋势及最终肿瘤平均重量的比较可以发现，单纯超声组0.4 W/cm2(U1)、0.8 W/cm2(U2)、1.6 W/cm2(U3)组，单纯Sonoflora10mg/kg(S1)、20mg/kg(S2)、40 mg/kg(S3)组组间比较及与空白对照组(C)对比均无显著性差异(P＞0.05)。提示单独使用超声照射(0.4、0.8、1.6W/cm2)或单独注射Sonoflora(10、20、40 mg/kg)均不能明显有效的抑制肿痛生长。③Sonoflora介导的声动力对S180肉瘤的杀伤作用通过对各组小鼠肿瘤体积的生长趋势及最终肿瘤平均重量的比较可以发现，单纯0.8 W/cm2超声组(U2)、单纯10mg/kg Sonoflora(S1)与空白对照组(C)对比均无显著性差异(P＞0.05)，而0.8 W/cm2超声和10mg/kg Sonoflora联合治疗组(S1U2)其肿瘤体积及重量较单纯超声(U2)、单纯声敏剂(S1)及对照组(C)显著减少(P＜0.05)。提示超声联合Sonoflora(10mg/kg+0.8W/cm12)介导的声动力具有协同抗肿瘤作用。④Sonoflora介导的声动力疗效与超声波的强度关系通过对各组小鼠肿瘤体积的生长趋势及最终肿瘤平均重量的比较可以发现，3组声动力组10mg/kg+0.4 W/cm2(S1U1)、10mg/kg+0.8 W/cm2(S1U2)、10mg/kg+1.6 W/cm2(S1U3)与空白对照组(C)对比均有显著性差异(P＜0.05)，10mg/kg+0.4 W/cm2(S1U1)与10mg/kg+0.8 W/cm2(S1U2)、10mg/kg+1.6 W/cm2(S1U3)对比有显著性差异(P＜0.05)，而10mg/kg+0.8 W/cm2(S1 U2)与10mg/kg+1.6 W/cm2(S1 U3)对比无显著性差异(P＞0.05)。提示Sonoflora浓度为10mg/kg情况下，0.4、0.8、1.6W/cm2强度的介导的声动力均对S180肿瘤生长产生明显抑制作用(P＜0.05)，而固定Sonoflora浓度为10mg/kg情况下，0.8W/cm2强度介导的声动力已达最大抑制肿瘤强度。⑤四组瘤荷瘤小鼠的腹腔注射后不同时间点白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、直接胆红素、乳酸脱氢酶、磷酸肌酸无显著性差异(p＞0.05)。Sonoflora40mg/kg腹腔注射后48h、72h的血肌酐与对照组、20mg/kg、10mg/kg组有显著性差异(p＜0.05);72h的血尿素氮也与对照组、20mg/kg、10mg/kg组有显著性差异(p＜0.05)。提示Sonoflora浓度40mg/kg腹腔注射对荷瘤小鼠肾功有损害作用，导致血肌酐、尿素氮升高。而10mg/kg、20mg/kg浓度的Sonoflora对荷瘤小鼠血常规、肾功、肝功、心功的无损害作用。
　　 结论：⑴在S180荷瘤小鼠中，Sonoflora具有肿瘤靶向性好、体内代谢快的优点;Sonoflora腹腔注射后18h是进行超声处理的理想时间点。⑵在Sonoflora10mg/kg的浓度下，超声联合Sonoflora显著抑制小鼠S180肉瘤生长，且0.8W/cm2强度介导的声动力达最大抑制肿瘤，与1.6 W/cm2无显著性差别(P＞0.05)。⑶10～20mg/kg浓度的Sonoflora腹腔注射S180肉瘤荷瘤小鼠后3h～72h是安全的。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 恶性肿瘤的治疗现状

1．2 光动力学疗法

1．3 声动力学疗法

1．4 影响声动力学疗法的因素

1．5 声动力与光动力联合应用

第2章 立论依据及研究目的

第3章 Sonoflora在S180荷瘤小鼠肿瘤组织和肌肉组织的分布

3．1 引言

3．2 材料和仪器

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

第4章 Sonoflora联合超声对S180肉瘤的杀伤作用

4．1 引言

4．2 材料和和仪器

4．3 实验方法

4．4 结果

4．5 讨论

第5章 Sonoflora对S180肉瘤荷瘤小鼠的安全性评估

5．1 引言

5．2 材料和和仪器

5．3 实验方法

5．4 结果

5．5 讨论

第6章 Sonoflora声动力治疗S180荷瘤小鼠作用机制的初步探讨

6．1 引言

6．2 材料和仪器

6．3 实验方法

6．4 实验结果

6．5 讨论

第7章 总结与展望

参考文献

硕士研究生期间发表论文情况

致谢

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