家蚕核型多角体病毒BV病毒结构蛋白间的互作网络及GP64与相关蛋白互作分析

摘要

杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80-180kb，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒区别于其他病毒的一个显著特征是病毒生活史中产生两种不同的病毒粒子形态:一种为包埋型病毒粒子(Occlusion-derived virus，ODV)，在病毒经口感染过程中，ODV在宿主中肠强碱性环境下从包涵体内释放，感染中肠上皮细胞实现原发感染;另一种为出芽型病毒粒子(budded virus，BV)，主要介导细胞与细胞之间的感染。两种类型病毒粒子都由多种结构蛋白组成，其中BV囊膜的结构较ODV简单，病毒结构蛋白通过相互之间的作用共同形成完整的病毒粒子，并且这些相互作用还具有除结构支撑以外的其他功能。本研究以家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）为研究对象，利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术对其BV病毒结构蛋白间的相互作用进行了分析和验证。为进一步探讨病毒囊膜与核衣壳等结构在病毒入侵细胞过程中的作用，构建了能够同时标记BV病毒囊膜和衣壳的重组双荧光病毒。利用序列截短突变的方式对BV最重要的囊膜融合蛋白GP64与相关蛋白间的互作进行了深入分析，阐明了其参与互作的关键结构域。主要结论如下:
　　1、探明了BV病毒粒子结构蛋白间的相互作用网络
　　通过对27个主要BV结构蛋白进行酵母双杂交一对一筛选，发现了57对蛋白相互作用，其中6对为自相互作用。进一步用免疫共沉淀技术验证了其中的10对相互作用。根据迄今为止关于杆状病毒蛋白互作的研究，发现VP39、FP和38K是杆状病毒蛋白互作网络中参与蛋白互作最多的三个关键蛋白，由此推测它们可能是病毒结构的主要骨架;还发现每种囊膜蛋白都与至少一个衣壳蛋白发生互作。根据这些蛋白互作信息，最终确立了5组BV结构蛋白间的互作网络。这些结果对于深入理解杆状病毒的结构具有重要参考意义。
　　2、成功构建了同时标记病毒囊膜和衣壳的双荧光重组病毒
　　为进一步探究BV结构蛋白中病毒囊膜和衣壳蛋白间的互作以期揭示病毒囊膜及衣壳这两个结构在病毒感染细胞过程中的作用，构建了能够同时标记病毒囊膜及衣壳的双荧光病毒。利用“λ-red同源重组系统”将BmNPV病毒本身的vp39和gp64基因双敲除，并在此基础上利用该重组系统将融合有3个红色荧光mCherry膜，这与GP64和VP39的共定位相似，暗示GP64可能参与将PKIP转运入细胞核。

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论文说明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1．1 杆状病毒的分类

1．2 杆状病毒的生活周期

1．3 杆状病毒的结构蛋白及其相互作用的研究进展

1．4 杆状病毒结构蛋白与囊膜蛋白GP64相互作用的研究

2 本研究目的及科学意义

第二章 家蚕核型多角体病毒BV病毒结构蛋白之间的互作网络分析

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．3．1 酵母双杂交载体的构建和自激活验证

2．3．2 酵母双杂交揭示57对蛋白互作

2．3．3 病毒衣壳蛋白间的相互作用

2．3．4 病毒囊膜蛋白间的相互作用

2．3．5 病毒衣壳蛋白与囊膜蛋白间的相互作用

2．3．6 病毒结构相关蛋白与结构蛋白间的相互作用

2．3．7 病毒结构相关蛋白间的相互作用

2．3．8 免疫共沉淀验证蛋白质相互作

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 双荧光标记的家蚕核型多角体病毒构建

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．3．1 λ-Red同源重组系统敲除gp64和vp39

3．3．2 利用“Bac-to-Bac杆状病毒表达系统”构建双色荧光病毒

3．3．3 双色荧光的观察

3．3．4 GP64与VP39在细胞中亚定位的观察

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 病毒主要囊膜蛋白GP64与衣壳蛋白VP39之间互作特点分析

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 结果

4．3．1 囊膜蛋白GP64结构域分析

4．3．2 GP64截短后与VP39互作的酵母双杂交验证

4．3．3 Co-IP验证

4．3．4 GP64截短突变体与VP39的共定位研究

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 GP64与FP、PKIP、38K之间互作特点的分析

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3．1 GP64截短后与FP、PKIP、38K互作的酵母双杂交互作验证

5．3．2 GP64截短突变体与FP、PKIP的共定位研究

5．4 讨论

5．5 本章小结

论文结论、创新点与展望

参考文献

附图

作者简历

发表论文

博士期间获得荣誉

致谢