NETs的形成对铜绿假单胞菌性角膜炎进展和预后影响的研究

摘要

细菌性角膜炎是临床最常见的致盲性角膜病变之一，如果治疗不及时往往会导致不同程度的角膜疤痕，甚至角膜穿孔和眼球丧失。铜绿假单胞菌是细菌性角膜炎的主要病原菌。由于该病原菌具有高细菌毒力，临床表现为发病急、进展快，短期内导致角膜穿孔，因此早期干预和有效治疗对改善铜绿假单胞菌性角膜炎的预后具有重要的临床意义。为了改善铜绿假单胞菌性角膜炎的预后，相关抗炎杀菌的基础研究显得尤为重要。中性粒细胞是感染性角膜炎中重要的炎症细胞，它能直接吞噬细菌，产生活性氧物质(ROS)和脱颗粒释放炎性因子引起大量细胞聚集放大炎症反应以杀伤病原体。中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellula traps，NETs)是最新发现的中性粒细胞抗感染机制。当中性粒细胞被病原菌刺激活化后，它主动向细胞外释放由染色质、NE、MPO颗粒组成的混合物，形成网状结构即为NETs，诱捕并杀死病原体，这一过程称之为NETosis。目前NETs已被证实在真菌和金黄色葡萄球菌感染角膜时起杀菌作用，但对铜绿假单胞菌感染的报道较少。此外,NETs持续存在会损伤组织，及时清除NETs能减轻组织损伤。本实验主要研究铜绿假单胞菌性角膜炎中NETs是否参与杀菌过程，以及NETs的形成对铜绿假单胞菌性角膜炎进展和预后的影响。 研究目的： 研究铜绿假单胞菌性角膜炎中性粒细胞胞外陷阱的杀菌作用，探讨药物干预NETs形成对角膜炎的进展和预后的影响。 研究方法： 选择6～8周龄的C57BL/6小鼠，随机分成损伤对照组和角膜炎组。角膜炎组包括妥布霉素地塞米松组（以下简称妥地组）、妥布霉素组和生理盐水组。损伤对照组刮去角膜上皮后接种灭菌生理盐水，角膜炎组采用改良型角膜表面镜片法建立小鼠细菌性角膜炎模型，接种的铜绿假单胞菌菌液浓度为106CFU。各组模型建立后，损伤对照组不滴用任何滴眼液，角膜炎组分别接受妥布霉素地塞米松滴眼液（妥地组）、妥布霉素滴眼液（妥布霉素组）和灭菌生理盐水（生理盐水组），点眼次数均为1滴/次，3次/日，分别于第1、3、5、7、10天行裂隙灯检查、采集眼前段照片并记录临床评分和角膜穿孔例数，观察持续直至小鼠角膜炎完全愈合;在病程的不同时期取角膜组织切片和溃疡灶刮片进行免疫荧光染色观察中性粒细胞和NETs的变化;普通HE染色观察感染角膜炎症反应和炎症细胞浸润情况;扫描电镜下观察NETs微观形态变化;角膜组织细菌负荷量检测杀菌效率。所有数据均采用SPSS24.0统计软件进行统计，各组组间比较采用方差分析，用GraphPad Prism6绘制图形。p＜0.05为差异有统计学意义。 研究结果： 1.小鼠铜绿假单胞菌性角膜炎自然病程第1天，大量中性粒细胞迅速浸润角膜组织，可见NETs形成。第3天炎症最重，中性粒细胞浸润增加，释放了大量NETs。第7天炎症开始缓慢减轻，角膜内的中性粒细胞和NETs相应减少。损伤对照组第1天少量中性粒细胞浸润角膜，但未见NETs形成，第3天已无中性粒细胞浸润。 2.损伤对照组第1天角膜上皮缺损，表面粗糙，至第3天角膜上皮愈合，角膜透明。角膜炎组第1天表现为角膜雾状混浊伴水肿，炎症细胞浸润，三组间表现基本一致。药物治疗后三组差别明显，妥地组角膜炎症角膜损伤最轻，恢复最快，预后最佳，主要表现：第3天角膜混灰色混浊，各层结构轻度紊乱，炎症细胞浸润少。扫描电镜下见NETs少且结构稀疏。第5天和第3天比较无明显变化。第7天炎症开始减轻，仍可见NETs。第10天角膜上皮愈合，各层结构整齐，未见NETs，至第20天角膜炎完全愈合。生理盐水组角膜损伤重，恢复慢，预后差，主要表现：第3天角膜致密混浊伴高度水肿，角膜明显溶解，大量炎症细胞浸润角膜全层，各层结构紊乱。扫描电镜下见大量NETs形成。第5天和第3天比较无明显变化。第7天炎症开始减轻，但仍见大量中性粒细胞及致密的NETs。第10天仍可见NETs，至第30天完全愈合。妥布霉素组介于前两组之间，至第24天完全愈合。发病第3、5、7、10天，同时期生理盐水组总分＞妥布霉素组＞妥地组，生理盐水组和妥地组之间差异有统计学意义(FD3=4.35，PD3=0.04，FD5=6.81，PD5=0.02，FD7=6.17，PD7=0.02，FD10=17.60，PD10=0.002)，生理盐水组和妥布霉素组分别在第3天和第7天的差异有统计学意义(FD3=4.95，PD3=0.03，FD7=5.07，PD7=0.04)，妥地组和妥布霉素组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。 3.细菌负荷量结果显示在药物治疗后第1、3天角膜炎各组细菌浓度差异无统计学意义。第7天妥地组和妥布霉素细菌量较少，至第10天两组无细菌生长，而生理盐水组仍有细菌生长(F2'D7=39.16，P2'D7=0.003，F3'D7=87.63，P3'D7=0.001，F D10=21.00，PD10=0.002)。同时期妥地组与妥布霉素组的细菌量无明显差异(p＞0.05)。 4.妥地组有2例小鼠发生角膜穿孔，妥布霉素组3例，生理盐水组12例。妥地组、妥布霉素组和生理盐水组之间差异均有统计学意义(F4=8.88，P4=0.004，F5=6.65，P5=0.01)，妥地组和妥布霉素组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。 研究结论： 1.NETs参与铜绿假单胞菌性角膜炎的病变过程，NETs形成情况与病情进展和预后相关。 2.糖皮质激素抑制铜绿假单胞菌性角膜炎中NETs的形成，减轻角膜组织的损伤，改善预后。 3.糖皮质激素并不降低抗菌素在铜绿假单胞菌性角膜炎的抗菌效率。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1引言

2材料与方法

2．1 材料

2．2实验方法

3 结果

3．1损伤对照组

3．2铜绿假单胞菌性角膜炎组

4讨论

5 结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果