含多种人工设计功能域胶原蛋白的高效制备及应用开发

摘要

胶原蛋白作为细胞外基质中重要的结构蛋白，是人体中含量最多的蛋白质，占人体干重的30％，不仅为细胞提供了生理环境，维持生命体组织形态，还参与影响细胞粘附、增殖、迁移以及信号传导等生化活动，具有促进组织或器官的修复及再生等生物学功能。但由于动物组织提取胶原蛋白存在动物源疾病风险，限制了动物源提取胶原蛋白的应用。近年来，一种来源于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的的三螺旋结构类胶原蛋白引起了科学家们的兴趣，但由于这种原核来源的Scl2胶原蛋白缺乏与哺乳动物细胞结合的功能位点，在改造之前并不具有生物学功能，故本研究意在通过替换和插入的方式给Scl2重组胶原蛋白增加功能位点，并探索其在生物材料领域的应用。
　　首先本文从分子层面上展开了对Scl2重组胶原蛋白骨架上功能位点的改造，通过PCR引物设计将不同数量的RGD（Arg-Gly-Asp）序列以定点突变的方式引入Scl2胶原蛋白骨架上。再采用同源重组的方式将天然Ⅰ型胶原蛋白与整合素的结合位点(GFPGER)取代Scl2骨架中对应的氨基酸序列，从而获得两组不同整合素位点功能化的Scl2胶原蛋白。并通过SDS-PAGE验证了各目标蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，2×YT摇瓶上的表达量为1.2 g/L。
　　接下来本文根据Scl2胶原蛋白特殊的(Gly-Xaa-Yaa)n三螺旋结构可以抵抗多种蛋白酶水解的特性，实现了一种免除色谱柱繁琐操作便于大规模生产的新型纯化方式，并总结了一套基于胃蛋白酶高效纯化Scl2系列胶原蛋白的工艺流程。在酶法水解实验过程中，胃蛋白酶不仅可以消化去除大部分宿主细胞杂质蛋白，切除前端结构蛋白V-domain，同时能够检验胶原蛋白三螺旋结构稳定性，将编码错误的胶原蛋白进行降解，仅保留正确构象的Cl-domain。最终，通过一系列纯化得到了电泳纯化级别的5种胶原蛋白冻干粉。
　　最后，本文通过用Scl2系列改造胶原蛋白对细胞培养材料进行表面处理的方式，初步验证了Scl2系列改造胶原蛋白的生物学活性，Scl2-R-Ⅰ和Scl2-5R-Ⅰ对于L929细胞具有促进其贴壁生长的效果（效果优于鼠尾Ⅰ型胶原蛋白），而Scl2-R则表现出抑制L929细胞贴壁的特性（与空白对照相比），说明可以通过改变蛋白质的作用位点来影响蛋白质间的相互作用，从而影响细胞行为，证明了实验思路的可行性及有效性，为Scl2系列蛋白发展成为特定功能性生物材料提供探索思路。

目录

声明

致谢

摘要

1．1 细胞外基质

1．1．1 基膜

1．1．2 细胞基质黏附

1．2 胶原蛋白的研究进展

1．2．1 胶原蛋白的种类及结构特征

1．2．2 胶原蛋白的生物合成

1．2．3 类胶原蛋白的研究进展

1．2．4 类胶原蛋白的重组表达

1．3 重组胶原蛋白Scl2的研究迸展

1．3．1 Scl2胶原蛋白的结构解析

1．3．2 Scl2胶原蛋白的工业化潜能

1．3．4 Scl2胶原蛋白骨架的功能位点改造

1．3．5 Scl2胶原蛋白融合表达小分子多肽的应用

1．3．6 Scl2胶原蛋白在组织工程应用领域的开发

1．4 整合素家族

1．4．1 整合素的结构及分类

1．4．2 整合素的激活机制

1．4．3 整合素结合配体

1．4．5 RGD在组织工程中的应用

1．4．6 RGD靶向抗肿瘤药物研究

1．5 本论文研究思路和主要内容

2．1．1 菌株及质粒

2．1．2 主要试剂、工具酶及试剂盒

2．1．3 培养基及缓冲液

2．1．4 实验试剂的配制

2．2 实验仪器

2．3 实验及分析方法

2．3．1 分子克隆实验

2．3．2 感受态细胞转化

2．3．3 SDS-PAGE电泳

2．3．4 蛋白样品脱盐

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 质粒与菌株

3．2．2 工具酶及主要试剂

3．2．3 培养基和缓冲液

3．2．4 分子生物学基本操作

3．2．5 引物设计与合成

3．2．6 RGD系列位点引入

3．2．7 GFPGER位点引入

3．2．8 重组Scl2系列胶原蛋白的表达

3．3 结果与讨论

3．3．1 RGD系列位点引入

3．3．2 GFPGER位点弓1入

3．3．3 Scl2系列蛋白在大肠杆菌中的表达

3．4 本章小结

4．1 前言

4．2 实验材料

4．3．1 Ni2+柱亲和层析

4．3．2 酸法沉降

4．3．3 木瓜蛋白酶法水解

4．3．4 胃蛋白酶水解

4．3．5 蛋白质脱盐与浓缩

4．3．6 蛋白质的保存

4．4 结果与讨论

4．4．1 Ni2+柱亲和层析

4．4．2 酸法沉降

4．4．3 蛋白酶水解

4．5 本章小结

5．1 前言

5．2 实验材料

5．2．1 细胞与黏附分子

5．2．2 实验试剂及设备

5．3 实验方法

5．3．1 蛋白浓度测定

5．3．2 细胞培养

5．3．3 细胞悬滴培养

5．3．4 黏附实验

5．4 结果与讨论

5．4．1 蛋白定量浓度测定

5．4．2 MiaPcCa-2细胞悬滴培养

5．4．3 PSC细胞悬滴分散效果

5．4．4 L929细胞黏附效果

5．4．5 HUVEC细胞黏附效果

5．5 本章小结

第六章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献