草酸青霉Penicillium oxalicum SL2对Pb2+的生物固定化、形态转化及分子机制研究

摘要

重金属铅(Pb)污染问题由来已久，污染范围广且具有高生物毒性，对生态环境及人体健康构成严重威胁。由于Pb的不可降解性，利用功能微生物进行Pb吸附及固化稳定化，降低其生物毒性的修复思路越来越受到研究者的关注。值得注意的是，微生物修复技术往往受制于菌株重金属耐受性、去除效率等，因此在关注Pb去除效率的同时，菌株对Pb的形态转化及其耐受解毒机制的研究探索十分必要。本文以草酸青霉SL2(Penicillium oxalicum SL2)为研究对象，综合利用电子成像技术、光谱技术、同步辐射技术、蛋白组学及代谢组学联合分析等，进行重金属Pb的微生物修复研究。主要研究内容包括:Pb2+耐受性及吸附累积规律;Pb2+在P.oxalicum SL2作用下的微生物结晶及形态转化机制研究;Pb2+胁迫下P.oxalicum SL2的蛋白组学和代谢组学响应机制。主要研究结果如下:
　　(1)弄清P.oxalicum SL2对Pb2+的耐受能力及Pb吸附累积规律。P.oxalicum SL2对Pb2+的最低抑制浓度(MIC)值为2500-2600mg/L，半数有效浓度(EC50值)为607.55mg/L，具有较好的Pb耐受性。在Pb2+初始浓度为2500mg/L，培养时间7d的条件下，最高Pb2+去除率为155.6±8.0mg/g dw，且去除方式以胞外吸附为主。拟二级动力学方程和Freundlich等温吸附方程可分别较好的拟合P.oxalicum SL2对Pb2+的吸附动力学及等温吸附过程，限速步骤为化学吸附，具备较高的吸附容量，与Pb的亲和力较高，属于优惠型吸附。傅里叶红外表面基团分析显示，Pb2+胁迫下P.oxalicum SL2细胞表面多糖、糖蛋白、可溶性蛋白及磷脂大分子的含量升高，表面羧酸盐含量变化较大，表面多肽含量同样上升，部分解释了P.oxalicum SL2菌丝体与Pb2+亲和力较高且吸附容量大的原因。
　　(2)阐明P.oxalicum SL2的Pb2+形态转化机制。在P.oxalicum SL2的Pb2+固定化过程中，通过光学显微镜及扫描电子显微镜-能谱(SEM-EDS)分析，发现菌丝体胞外形成了纳米级和微米级的含Pb次生矿物。进一步利用透射电镜-能谱分析(TEM-EDS)方法，确定了Pb可渗透到P.oxalicum SL2胞内，并形成含Pb复合物。为更深入解P.oxalicum SL2中Pb的形态转化机制，使用了X-射线吸收近边结构(XANES)技术，结果显示菌丝体中Pb形态主要为草酸铅、柠檬酸铅、磷酸氢铅及谷胱甘肽铅类似物。为进一步验证该结果的可信性，对胞内谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量进行检测，发现Pb2+胁迫下胞内GSH和GSH/GSSG值显著提高，尤其是高浓度Pb2+处理组，GSH及GSSG含量显著提高。另外，通过离子色谱检测发现在高浓度Pb2+胁迫下柠檬酸分泌量显著增加，磷酸氢根含量随时间变化不断升高，而中低浓度Pb2+处理可显著提高草酸分泌量。胞内磷酸酶(AKP,ACP)含量在Pb2+处理下同样出现显著变化。判断GSH合成、有机酸分泌及有机磷水解作用的加强可能是P.oxalicum SL2进行Pb形态转化，抵御Pb2+生物毒性的重要手段。
　　(3)揭示P.oxalicum SL2在Pb2+胁迫下的蛋白质组响应机制。糖分解代谢与能量合成方面，P.oxalicum SL2在Pb2+胁迫下海藻糖通路被激活，进而打开糖酵解通路，提高了果糖二磷酸醛缩酶和磷酸甘油酸变位酶活性，为Pb2+胁迫下的细胞提供额外能量;氨基酸合成与信号传导方面，通过上调结合类、抗氧化类、分子伴侣及DNA损伤修复相关蛋白的表达，提高细胞抗逆性;抗氧化应激及防御机制方面，可通过几丁质合成通路的激活建立了第一道胞外防御机制，并促进胞内半胱氨酸合成相关蛋白及谷胱甘肽S-转移酶的表达，从而建立胞内Pb螯合解毒的第二道抗氧化应激机制，第三道防御机制则是通过转运蛋白的过表达来促进Pb螯合物的区室化或泵出。
　　(4)明确P.oxalicum SL2在Pb2+胁迫下的代谢组响应机制。通过非靶向代谢组学的鉴定分析，发现cAMP信号通路在应对Pb2+生物毒性过程中发挥重要作用，主要通过GPCR结合相关的代谢物实现下游信号通路的调控，并进一步证实了蛋白组中几丁质合成通路的激活;脯氨酸、组氨酸及谷氨酰胺的合成及其所在的ABC转运通路对于抵抗Pb2+毒性十分重要;TCA循环的激活可为该菌株抵抗Pb2+毒性提供更有效的物质及能量供应机制，包括柠檬酸分泌的显著增加，并再次验证了GSH系统在解毒过程中的关键作用;P.oxalicum SL2可通过糖酵解通路的激活抵抗Pb2+毒性并获得额外能量，这与蛋白组结果相符;此外，Pb2+胁迫下细胞分裂活性及DNA损伤修复能力增强。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章绪论

1．1 Pb的污染现状及危害

1．1．1 Pb的理化性质

1．1．2 Pb的毒性

1．1．3我国Pb环境污染现状

1．2微生物对Pb的耐受及吸附累积

1．2．1不同微生物对Pb的耐受能力

1．2．2微生物对Pb的吸附累积

1．2．3影响微生物吸附累积Pb的因素

1．3微生物对重金属的形态转化

1．3．1胞外矿化作用

1．3．2胞内耐受及形态转化

1．3．3重金属形态转化的检测方法

1．4微生物与重金属的分子作用机制

1．4．1微生物的分子机制检测方法

1．4．2微生物在重金属胁迫下的蛋白组学响应

1．4．3微生物在重金属胁迫下的代谢组学响应

1．5论文研究目标及基本思路

1．5．1研究目标与意义

1．5．2研究内容

1．5．3研究思路

第二章P．oxalicum SL2对Pb的耐性及吸附累积规律

2．1引言

2．2材料和方法

2．2．3最低抑制浓度(EC50值)

2．2．4不同初始pH值对Pb2+去除的影响

2．2．5不同初始Pb2+浓度对去除率的影响

2．2．6胞外吸附和胞内吸收

2．2．7吸附等温线

2．2．8吸附动力学

2．2．10傅里叶红外(FTIR)检测

2．2．2不同初始pH值下P．oxalicum SL2对Pb2+的去除效率

2．2．3不同初始Pb2+浓度处理下的葡萄糖消耗

2．2．4不同初始Pb2+浓度下P．oxalicum SL2对Pb2+的固定化及去除

2．2．5不同浓度Pb作用下SL2的胞内吸收及胞外吸附量

2．2．6吸附动力学

2．2．7吸附等温线

2．2．8菌丝体表面基团分析

2．4讨论

2．4．3 P．oxalicum SL2对Pb的胞外吸附特征

2．5小结

第三章Pb2+在P．oxalicum SL2作用下的徼生物结晶及形态转化机制

3．1引言

3．2材料和方法

3．2．4透射显微镜及能谱联用(TEM-EDS)观察

3．2．7离子色谱检测方法

3．2．8胞内谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽(GSH／GSSG)检测

3．2．9胞内碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)检测

3．2．10数据统计分析

3．3结果与分析

3．3．1次生矿物光镜观察及主要成分分析

3．3．2菌丝体及次生矿物的SEM-EDS分析

3．3．3 P．oxalicum SL2形态学观察及次生矿物元素组成

3．3．4菌丝体中Pb形态转化

3．3．5胞内GSH及GSSG含量变化

3．3．6柠檬酸与草酸产量的变化

3．3．7溶液中磷酸氢根含量的变化

3．3．8菌丝体中磷酸酶活性的变化

3．4讨论

3．4．1微生物结晶与重金属固定化的关系

3．4．2有机酸对Pb形态转化的影响

3．4．3磷与Pb形态转化的关系

3．4．4谷胱甘肽对Pb形态转化的作用

3．5小结

第四章P．oxalicum SL2在Pb2+胁迫下的蛋白组学响应机制

4．1引言

4．2材料和方法

4．2．1菌丝体处理收集

4．2．3数据统计分析

4．3结果与分析

4．3．1肽段和蛋白质鉴定与定量结果评估

4．3．2 Pb2+诱导的菌丝体蛋白差异表达

4．3．3差异表达蛋白的功能分析

4．3．4蛋白质聚类分析

4．3．5差异表达蛋白的KEGG通路分析

4．3．6差异表达蛋白质的互作网络分析

4．4讨论

4．4．1 Pb2+胁迫下菌丝体糖分解代谢与能量合成响应

4．4．2 Pb2+胁迫下菌丝体氨基酸合成与信号传导响应

4．4．3 Pb2+胁迫下菌丝体抗氧化应激及防御机制响应

4．5小结

第五章P．oxalicum SL2在Pb2+胁迫下的代谢组响应机制

5．1引言

5．2材料和方法

5．3．1质量控制

5．3．2各组样本的典型代谢谱图

5．3．3数据预处理

5．3．4显著性差异代谢物筛选

5．3．5差异代谢物聚类分析

5．3．6差异代谢物KEGG通路富集分析

5．4讨论

5．4．1信号传导通路

5．4．2蛋白转运通路

5．4．3三羧酸循环(TCA)

5．4．4糖代谢通路

5．4．5核苷酸代谢通路

5．5小结

第六章研究结论、创新点及展望

6．1研究结论

6．1．3 P．oxalicum SL2在Pb2+胁迫下的蛋白质组响应机制

6．2创新点

6．3研究展望

参考文献

图索引

表索引

作者简历及攻读博士期间成果