基于调控星形胶质细胞代谢的1,6--二磷酸果糖抗癫痫机制研究

摘要

研究目的: 癫痫是一种复杂的神经系统综合征，神经元异常放电引起的癫痫发作是其主要临床表现，药物治疗是控制癫痫发作的主要手段。现有药物主要作用于突触离子通道和神经递质受体从而抑制癫痫发作，但是对疾病本身及认知功能降低等神经精神并发症无效，甚至可能加重神经精神症状。越来越多的研究证实代谢紊乱与癫痫发生发展密切相关，其中星形胶质细胞代谢紊乱可能起到重要作用。我们前期研究发现，糖酵解中间产物1，6-二磷酸果糖(FBP)具有显著抗癫痫作用，不仅能抑制癫痫发作而且可以改善慢性癫痫动物的认知功能。本课题旨在围绕核心科学假说——FBP可以协同调控星形胶质细胞的糖代谢和谷氨酸代谢，从而发挥防治癫痫发作、修复脑损伤的作用——阐明FBP的新颖抗癫痫机制，从而揭示FBP较现有抗癫痫药物的特点及优势。 研究内容: (1) FBP对慢性癫痫的治疗作用及其作用特点:用毛果芸香碱诱导的慢性自发性颞叶癫痫模型，对比研究一线抗癫痫药包括丙戊酸钠和左乙拉西坦，和FBP于给药期间和停药后的抗癫痫发作药效;用Morris水迷宫试验评价一线抗癫痫药和FBP对癫痫动物学习记忆能力的影响。(2)探究FBP抑制糖酵解作用与其抑制癫痫发作的关系:采用清醒动物脑微透析的方法研究FBP对慢性癫痫动物发作间期和发作期乳酸水平和神经递质水平的影响;随后于毛果芸香碱诱导的急性癫痫发作模型中利用靶向工具药阻断乳酸穿梭，以观察其对急性癫痫发作、乳酸水平和神经递质水平的影响，从而对比分析FBP的作用方式和作用特点。(3)探究FBP对星形胶质细胞糖代谢和谷氨酸代谢的影响:利用同位素标记的谷氨酸钠联合质谱检测分析FBP处理对谷氨酸在人星形胶质细胞HA细胞中多条代谢通路的影响，包括进入三羧酸循环代谢、流向谷胱甘肽(GSH)合成和经由经典通路转化为谷氨酰胺等。(4)采用免疫组织化学的方法考察FBP对慢性癫痫动物海马区的神经保护作用。 实验结果: (1) FBP在慢性癫痫模型中表现出相较于阳性药物更快速、更稳定、更持久的抑制癫痫发作的效果，特别是在停药后仅有FBP组动物能够维持抗癫痫效果;同时仅有FBP对慢性癫痫动物的学习能力具有改善作用。(2) FBP可以对抗癫痫发作诱导因素引起的慢性癫痫动物海马区乳酸水平升高，维持发作间期谷氨酸水平处于正常水平，并恢复谷氨酸能神经元对外界刺激的正常响应;两个不同靶点的乳酸穿梭阻断剂均能显著对抗癫痫发作，其中单羧酸转运体抑制剂强烈升高细胞间隙乳酸水平而乳酸脱氢酶抑制剂表现出明显抑制，二者均显著抑制谷氨酸水平使其大大低于正常水平;这种不同指出，FBP并非单纯地抑制星形胶质细胞糖酵解或乳酸穿梭而是调控其代谢活动和与此关联的神经递质代谢过程。(3)FBP可差别地调控HA细胞的糖代谢和谷氨酸代谢:FBP抑制糖酵解活动并促进葡萄糖进入三羧酸循环，但不影响其流向GSH合成通路;促进谷氨酸进入三羧酸循环氧化分解或进一步流向天冬氨酸合成，选择性促进胞外谷氨酸流向GSH合成并释放到细胞外，也同时促进谷氨酸转化为谷氨酰胺。(4) FBP改善慢性癫痫动物海马脑区星形胶质细胞和神经元随疾病发展而出现的退化。 研究结论: 一方面，FBP通过调控星形胶质细胞糖酵解稳定慢性癫痫动物脑内乳酸水平从而有利于抑制癫痫急性发作;另一方面FBP促进星形胶质细胞三羧酸循环，增强其谷氨酸清除能力并促进谷氨酸转化为脑内重要的抗氧化物质谷胱甘肽，从而将引发癫痫发作及神经退化的毒性物质快速转化为具有神经保护作用的物质。以上作用合理地解释了FBP兼具抑制癫痫发作和促进癫痫脑组织结构和功能修复的药效特色和优势。研究结果不仅为后续开发FBP为新型抗癫痫药物提供了药效和理论依据，也为研发更加安全有效的新型抗癫痫药物提供了线索。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1前言

1．1现有抗癫痫药物的局限

1．2 癫痫疾病与代谢异常

1．3 代谢调控与癫痫治疗

1．4 FBP抗癫痫作用的研究现状

2 FBP对慢性癫痫的治疗作用及其作用特点

2．1实验材料

2．1．1实验动物

2．1．2实验仪器

2．1．3实验药品与试剂

2．1．4 主要试剂的配制

2．2．1 自发性癫痫模型的建立

2．2．2学习能力的评价

2．2．3 FBP对慢性癫痫动物的抗癫痫药效研究

2．2．4抗癫痫药物对慢性癫痫动物学习能力的影响

2．2．5数据统计分析

2．3实验结果

2．3．1 FBP抑制慢性癫痫动物自发性癫痫发作

2．3．2 FBP保护慢性癫痫动物学习能力

2．4小结

3 FBP调控糖酵解抗癫痫的机制研究

3．1实验材料

3．1．1实验动物

3．1．2实验仪器

3．1．3实验试剂和药品

3．1．4主要试剂的配制

3．2实验方法

3．2．1高糖饮食与癫痫发作频率相关性的考察

3．2．2 FBP对慢性癫痫动物脑脊液中神经化学物质的调控作用

3．2．3阻断乳酸穿梭的抗癫痫作用研究

3．2．4微透析样本处理和测定

3．2．5数据分析方法

3．3实验结果

3．3．1 5％葡萄糖水可诱导慢性癫痫动物自发性癫痫发作

3．3．2 FBP维持慢性癫痫动物脑内神经化学物质稳定

3．3．3阻断星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭的抗癫痫作用

3．4小结

4 FBP增强星形胶质细胞谷氨酸清除和谷胱甘肽合成功能

4．1实验材料

4．1．1细胞株

4．1．2实验仪器

4．1．3实验试剂

4．1．4主要试剂的配制

4．2实验方法

4．2．3 FBP对HA细胞谷氨酸代谢的作用

4．2．4免疫组织化学方法考察FBP的神经保护作用

4．2．5数据分析方法

4．3实验结果

4．3．1 FBP促进星形胶质细胞代谢方式由糖酵解向氧化磷酸化转换

4．3．2 FBP促进谷氨酸进入三羧酸循环氧化分解或转化

4．3．3 FBP促进谷氨酸转化为谷氨酰胺

4．3．4 FBP促进星形胶质细胞利用外源性谷氨酸直接合成谷胱甘肽

4．3．5 FBP对星形胶质细胞谷胱甘肽水平和细胞分布的影响

4．3．6 FBP对慢性癫痫动物神经元和胶质细胞的保护作用

4．4小结

5讨论

参考文献

综述 星形胶质细胞-神经元代谢耦合及其作用

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