疏水性电荷诱导层析介质的吸附性能和作用机制研究

摘要

抗体是重要的生物药物和免疫诊断试剂，具有巨大的市场需求。基于蛋白A亲和层析的传统抗体分离方法存在成本高昂、配基泄露、洗脱条件苛刻等局限，制约了抗体产业的发展。疏水性电荷诱导层析（Hydrophobic charge induction chromatography,HCIC）作为一种新型抗体分离方法，具有吸附容量大、选择性较高、分离条件温和、成本较低等优点，具有良好的抗体分离应用潜力，但相关机理认识需要进一步加强。本文以商业化HCIC介质MEP HyperCel和三种新型HCIC介质（MMI、ABI和W-ABI介质）为主要研究对象，以静态吸附和等温滴定量热法（Isothermal titration calorimetry,ITC）为主要研究手段，考察了四种HCIC介质的蛋白吸附性能，并从热力学角度揭示HCIC介质的作用机理，为分离过程优化和新型配基设计提供重要依据。 首先，考察了MEP HyperCel介质的蛋白吸附性能研究。MEP HyperCel介质对三种抗体（hIgG、bIgG和mAb）的吸附容量均远大于两种血清白蛋白（HSA和BSA），体现出抗体分离的应用潜力。MEP HyperCel吸附具有较强的pH依赖性和一定的耐盐吸附特性。添加辛酸钠能够明显降低MEP HyperCel对BSA的吸附量，提高对IgG的选择性。实验发现，同时加入辛酸钠和一定浓度的NaCl，能够显著减少MEP HyperCel介质对BSA的吸附。温度升高也会一定程度减少BSA的吸附。 在吸附实验基础上，利用ITC对辛酸钠、MEP配基和MEP介质与蛋白相互作用进行了研究。发现辛酸钠-BSA间的相互作用大于辛酸钠-IgG，且辛酸钠-BSA相互作用以疏水作用为主。加入辛酸钠同时加入一定浓度NaCl，或者升高温度，会使辛酸钠与BSA间的疏水作用增强。同时，ITC结果表明，IgG与MEP配基之间的亲和力远高于白蛋白，且MEP-IgG间同时存在疏水作用、静电作用、氢键、范德华力等多种作用力。pH变化显著影响MEP与IgG之间的静电作用和疏水作用，导致MEP HyperCel介质对hIgG的吸附容量有较大的变化。此外，ITC结果揭示了MEP HyperCel介质耐盐吸附特性的热力学机制，即MEP配基与hIgG相互作用的过程中存在熵焓补偿现象，使得反应自由能的变化不大。 其次，考察了三种新型HCIC介质（MMI、ABI和W-ABI介质）的吸附性能研究。中性pH条件下，三种新型HCIC介质对hIgG均有较高的吸附容量，其中含有双功能配基的W-ABI介质对hIgG的吸附力最强，ABI介质次之，MMI介质最弱。三种介质同样体现出较明显的pH依赖性吸附特性和较好的耐盐吸附性能。相对而言，W-ABI介质的pH敏感性比另外两种介质弱。50％体积浓度的乙二醇可以较明显地降低MEP HyperCel、MMI和ABI介质的饱和吸附容量，但对W-ABI介质的吸附性能影响不大。1M精氨酸浓度下，四种HCIC介质的吸附容量均有所减小，但整体变化幅度不大，说明精氨酸对这四种介质的蛋白解吸促进作用并不明显。 最后，对新型HCIC介质-蛋白相互作用进行了ITC研究。考察了不同pH、NaCl浓度、乙二醇浓度和精氨酸浓度下，MMI、ABI和W-ABI与hIgG之间的相互作用，并与MEP HyperCel介质进行对比。发现pH对介质-蛋白相互作用的影响显著，不同介质的NaCl影响略有不同，加入乙二醇会屏蔽介质-蛋白间的疏水作用，而精氨酸的加入则会屏蔽静电作用。中性pH条件下，MMI、ABI和W-ABI介质均通过混合作用模式实现抗体的结合。其中，MMI介质的亲硫作用和疏水作用较强，静电作用较弱;ABI介质与MEPHyperCel介质的作用机理相近，但疏水作用的贡献要大于MEP HyperCel介质;W-ABI介质与hIgG间的作用力比较强，导致W-ABI介质具有很好的耐盐吸附性能，但对pH的依赖性没有其它三种介质高。 本文以了解HCIC介质的蛋白吸附性能和作用机理为出发点，探讨了pH、盐和特殊添加剂对吸附性能的影响，通过ITC实验探讨了HCIC介质与抗体之间的相互作用，揭示了HCIC介质的作用机理，为层析分离的过程优化和新型配基的设计提供重要的依据。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

符号表

缩略语表

第一章文献综述

1．1引言

1．2抗体

1．2．1抗体结构与功能

1．2．2抗体的应用

1．2．3抗体的分离纯化

1．3疏水性电荷诱导层析

1．3．2疏水性电荷诱导层析的功能配基

1．3．3疏水性电荷诱导层析的应用

1．4等温滴定量热法

1．4．1基本原理

1．4．2 ITC的应用范围

1．4．3层析作用机理研究方面的应用

1．5本文研究思路

第二章MEP HyperCel介质的吸附性能

2．1引言

2．2材料与方法

2．2．1试剂与仪器

2．2．2静态吸附平衡

2．2．3 zeta电位测定

2．3结果与讨论

2．3．1不同蛋白的吸附选择性

2．3．2 pH对MEP HyperCel介质吸附性能的影响

2．3．3加盐对MEP HyperCel介质吸附性能的影响

2．3．4辛酸钠对MEP HyperCel介质性能的影响

2．4本章小结

第三章辛酸钠、MEP配基及MEP介质与蛋白的相互作用

3．1引言

3．2材料与方法

3．2．1试剂与仪器

3．2．2辛酸钠-蛋白相互作用的ITC实验

3．2．4 MEP HyperCel介质-蛋白相互作用的ITC实验

3．2．5 zeta电位测定

3．3结果与讨论

3．3．1辛酸钠-蛋白相互作用

3．3．2 MEP与不同蛋白的相互作用

3．3．3 pH对MEP-蛋白相互作用的影响

3．3．4盐对MEP-蛋白相互作用的影响

3．4本章小结

第四章MMI、ABI和W-ABI介质的吸附性能

4．1引言

4．2材料与方法

4．2．1试剂与仪器

4．2．2静态吸附平衡

4．3结果与讨论

4．3．1 pH对MMI、ABI和W-ABI介质吸附性能的影响

4．3．2 NaCl浓度对MMI、ABI和W-ABI介质吸附性能的影响

4．3．3特殊添加剂对MMI、ABI和W-ABI介质吸附性能的影响

4．4本章小结

第五章新型HCIC介质与蛋白的相互作用

5．1引言

5．2材料与方法

5．2．1试剂与仪器

5．2．2 HCIC介质-蛋白相互作用的ITC实验

5．3结果与讨论

5．3．1 pH对HCIC介质-蛋白相互作用的影响

5．3．2 NaCl浓度对HCIC介质-蛋白相互作用的影响

5．3．3特殊添加剂对HCIC介质-蛋白相互作用的影响

5．4本章小结

第六章结论与展望

6．1结论

6．2展望

参考文献

攻读博士学位期间的研究成果

作者简介