DkHB4调控‘磨盘柿’果实采后软化的机制研究

摘要

柿果实采后极易软化，过度或快速的软化不利于采后贮藏，直接影响其流通和商品价值，因此果实软化始终是柿采后研究的重要课题之一。本文以‘磨盘柿’（Diospyros kaki.cv.Mopanshi）为实验材料，采用乙烯处理，利用RNA-Seq，通过基因克隆、实时荧光定量PCR、烟草双荧光素酶、酵母双杂交、BiFC等技术体系、亚细胞定位等，鉴别了受乙烯处理诱导的转录因子，并进一步明确其靶标基因，初步探索这些基因之间的作用机制。主要研究结果如下: 1.柿果实后熟软化相关基因的克隆与表达分析。依据RNA-Seq结果，筛选得到受乙烯处理诱导的转录因子和结构基因，并利用RACE技术获得了30个转录因子和13个结构基因的编码基因序列。利用实时荧光定量PCR(Q-PCR)，验证了其中27个转录因子和10个结构基因的表达在乙烯处理后快速软化的果实中显著上调。 2.响应乙烯处理的转录因子对细胞壁降解相关基因的作用效应分析。通过烟草双荧光素酶体系，鉴别到DkHB4、DkGATA3、DkWRKY12、DkNAC22能显著激活涩柿果实采后软化相关DkXTH9和DkPE9的启动子活性。点突变实验结果表明，DkHB4、DkGATA3、DkWRKY12均能直接结合DkXTH9启动子，DkNAC22能直接结合DkPE9启动子。 3.DkHB4与DkERFs的协同调控效应分析。进一步选择DkHB4为主要研究对象，分析了它与DkERFs的协同调控效应。烟草双荧光素酶体系研究发现DkHB4与DkERF8、DkERF16和DkERF19混合，均可显著提升对DkXTH9启动子的诱导效应。酵母双杂交和BiFC实验结果均表明DkHB4与DkERF16存在蛋白互作关系，但DkHB4与DkERF8和DkERF19并没有直接的蛋白互作关系。 综上所述，本论文克隆了受乙烯诱导的‘磨盘柿’果实转录因子及细胞壁降解基因，发现了多个调控细胞壁降解基因的转录因子，其中DkHB4既可直接结合DkXTH9的启动子，还可通过与DkERF16蛋白互作协同调控DkXTH9启动子。这些结果进一步丰富了乙烯加速柿果实后熟软化的转录调控机制。

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致谢

摘要

缩略词表

1文献综述

1．1柿概况

1．2乙烯与果实成熟软化

1．2．1乙烯概述

1．2．2乙烯促进果实成熟与软化

1．3细胞壁与果实质地软化

1．3．1细胞壁组成结构的变化

1．3．2细胞壁多糖物质的变化

1．3．3细胞壁物质降解相关酶

1．4转录因子与果实成熟软化

1．5柿果实质地机理研究进展

1．6研究目标和内容

2材料与方法

2．1实验材料、处理与生理指标测定

2．1．1果实材料与处理方法

2．1．2硬度测定

2．2转录组分析

2．2．1 RNA的提取

2．2．2基因功能注释与差异表达基因

2．2．3转录因子和细胞壁降解基因筛选

2．3基因克隆

2．3．1 RNA的提取和cDNA的合成

2．3．2基因全长与启动子克隆

2．4实时荧光定量PCR

2．5烟草双荧光素酶试验(转录调控效应分析)

2．6亚细胞定位分析

2．7酵母双杂交分析(蛋白互作)

2．8双分子荧光互补实验(蛋白互作)

2．9统计分析与作图

3结果与分析

3．1乙烯处理后对‘磨盘柿’果实硬度的影响

3．2转录组测序分析

3．3乙烯处理诱导的转录因子及细胞壁降解基因的筛选

3．4受乙烯处理诱导的转录因子和细胞壁降解基因的全长克隆

3．5实时定量PCR验证转录组结果

3．6乙烯诱导的转录因子对相关靶标基因启动子的调控效应

3．7受乙烯诱导的转录因子和细胞壁降解基因与脱涩后软化相关性分析

3．8 DkGATA3，DkHB4和DkNAC22的亚细胞定位分析

3．9 DkHB4，DkGATA3，DkWRKY12对DkXTH9启动子以及DkNAC22对DkPE9启动子的结合作用分析

3．10DkHB4与激活型转录因子DkERFs的共同调控效应分析

3．11酵母双杂分析DkHB4和DkERFs的蛋白互作关系

3．12双分子荧光互补验证DkHB4和DkERF16的蛋白互作关系

4讨论与小结

4．1讨论

4．2小结与展望

参考文献

作者学习经历及在学期间所取得的科研成果