番茄转录因子NAC29在调控生长和细菌性叶斑病抗性中的功能研究

摘要

近年来，我国蔬菜产业蓬勃发展，但生产上病虫害发生严重，这将长期制约着我国蔬菜产业的发展。丁香假单胞菌番茄变种（Pseudomonas syringae pv.tomatoDC3000，Pst DC3000）所引发的番茄细菌性叶斑病，是园艺栽培中极易发生的活体营养型细菌病害。生产上高度依赖化学杀菌剂，给生态环境和食品安全造成严重威胁。深入研究植物对于Pst DC3000的抗性机制能为建立抗病的方法提供新思路，新策略，因此具有重要的实际生产意义。NAC(NAM/ATAF/CUC)转录因子为植物六大转录家族成员之一，研究显示NAC家族参与调控生长发育以及植物对病原菌侵染等生物胁迫的防御反应相关进程。本文以番茄为研究对象，研究了转录因子NAC29在番茄调控生长以及防御Pst DC3000侵染中的作用及机制。所得主要研究结果如下: 1.研究了番茄NAC转录因子家族成员对Pst DC3000侵染的响应。本章主要利用实验室已有的转录组测序(RNA sequencing，RNA-Seq)数据，对Pst DC3000胁迫下的番茄NAC家族基因成员的响应进行分析。分析了101个番茄NAC基因在接种Pst DC3000后的相对表达强度，发现15个NAC基因在接种Pst DC3000后显著上调（上调倍数1.5-3750倍），对15个基因本底含量进行分析，剔除含量过低的4个基因，最终明确11个上调表达基因。进行实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)11个基因均有明显上调。其中，NAC29的相对表达量上升最大，高达22.9倍。为明确NAC29在植物细胞中的作用部位，对NAC29进行了亚细胞定位试验，结果表明NAC29定位于细胞膜和细胞核中。 2.在上一章分析番茄NAC转录因子家族成员对Pst DC3000侵染的响应，发现NAC29基因表达量受诱导表达量最高的基础上，猜想转录因子NAC29参与番茄防御Pst DC3000过程，且发挥重要作用。故本章将其作为研究对象，构建并鉴定了番茄NAC29基因过表达植株，得到两个上调近60倍的稳定遗传的纯合株系OE∶NAC29-1，OE∶NAC29-2。对过表达植株接种Pst DC3000，研究NAC29基因过表达对番茄植株防御Pst DC3000的影响。进行细胞菌落计数，相较于野生型，过表达株系OE∶NAC29-1，OE∶NAC29-2的Pst DC3000生长量显著下降，且光系统Ⅱ(PSⅡ)光化学效率(ΦPSⅡ)和台盼蓝染色结果与cfu测定结果一致，NAC29基因过表达后与野生型植株相比发病减轻。结果表明:NAC29基因过表达能显著增强番茄植株对Pst DC3000的防御能力。 3.在上一章明确了NAC29基因过表达能增强番茄植株对Pst DC3000的防御能力的基础上，本章研究番茄转录因子NAC29在防御Pst DC3000的过程与抗性相关基因的关系，探究NAC29转录因子在提高番茄防御能力中的作用机制。为进一步探究机理，筛选抗病相关基因的启动子序列，在7个基因均含有识别位点，于是选择了上调幅度大的MYB14（1个位点），识别位点较多的βCA3，GS2，Fd-GOGAT作为后续研究对象，通过qRT-PCR进一步筛选，发现β型碳酸酐酶3基因（βCarbonic anhydrase3，βCA3）在过表达植株，以及接种Pst DC3000后均有显著上调（接病后，βCA3基因表达量从野生型中的1383倍上调到过表达株系中的2523和2272倍）。随后进行凝胶迁移检测(Electrophoretic mobility shiftassay, EMSA)实验，结果表明，NAC29可以与βCA3启动子结合。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验也同样证明NAC29可以直接靶标βCA3启动子。随后通过病毒诱导的基因沉默技术(Virus induced gene silence，VIGS)验证βCA3在防御Pst DC3000中的作用，沉默βCA3，植株表现为更加感病，这与前人研究一致。结果表明:NAC29能特异性地识别βCA3启动子序列，进而调节βCA3的转录水平，提高βCA3的含量，最终导致番茄植株对Pst DC3000的防御能力增强。 4.在上一章实验基础上，发现植株生长表型有所变化，所以对其生长进行监测。NAC29基因过表达植株前期矮壮，后期长势与野生型相近;NAC29基因过量表达能使叶片中干物质量降低，果实中干物质量增加，果实干物质分配比重增加。结果表明转录因子NAC29可以通过增加干物质向果实的分配比重提高产量。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1引言

1．1园艺作物的病害

1．1．1园艺作物主要病害类型

1．1．2番茄细菌性叶斑病及其防治方法

1．2 NAC转录因子的结构与功能

1．2．1 NAC的结构特点以及调控网络

1．2．2 NAC调控植物对生物胁迫的响应

1．2．3 NAC调控植物发育进程

1．3本文的研究目的和意义

2番茄NAC转录因子家族成员对Pst DC3000侵染的响应

2．1材料和方法

2．1．1植物材料培养与处理

2．1．3 RNA转录组数据分析

2．1．4植物RNA提取反转录及qRT-PCR分析

2．1．5 NAC29的亚细胞定位实验

2．1．6方差分析

2．2结果与分析

2．2．1番茄NAC家族成员对Pst DC3000的响应

2．2．2接种Pst DC3000后番茄NAC转录因子响应的的验证

2．2．3 NAC29的亚细胞定位

2．3讨论

3 NAC29基因过表达对番茄植株防御Pst DC3000的影响

3．1试验材料与方法

3．1．1 NAC29基因过表达载体及植株的构建

3．1．2试验材料与方法

3．1．5台盼蓝染色实验

3．1．6方差分析

3．2结果与分析

3．2．1 NAC29基因过表达材料的验证

3．2．2 NAC29基因过表达对番茄防御Pst DC3000的ΦPSⅡ影响

3．2．3 NAC29基因过表达对番茄接种Pst DC3000后叶片死细胞数的影响

3．2．4NAC29基因过表达对番茄接种Pst DC3000后细菌生长的影响

4．3讨论

4番茄转录因子NAC29防御Pst DC3000的机制探究

4．1试验材料与方法

4．1．1材料培养与处理

4．1．2植物RNA提取反转录及qRT-PCR分析

4．1．3 NAC29原核表达载体构建蛋白诱导及纯化

4．1．4凝胶迁移检测实验(EMSA)

4．1．5染色质免疫共沉淀(ChIP)

4．1．6 VIGS侵染

4．1．9台盼蓝染色实验

4．1．10方差分析

4．2结果与分析

4．2．1抗Pst DC3000相关基因的启动子序列分析

4．2．2候选基因对NAC29基因过表达以及Pst DC3000处理的表达差异

4．2．3 NAC29与βCA3启动子结合

4．2．4βCA3对番茄植株防御Pst DC3000的影响

4．3讨论

5 NAC29基因过表达材料的构建及其对生长发育的影响

5．1试验材料与方法

5．1．1材料培养与处理

5．1．2生长指标的测定

5．1．3方差分析

5．2结果与分析

5．2．1 NAC29基因过表达对番茄植株生长的影响

5．2．2NAC29基因过表达对番茄植株产量的影响

5．3讨论

6结论

参考文献