反义c-myc对MCF-7细胞hTERT基因表达抑制作用的研究

摘要

目的：研究脂质体LipfectAMINETM（LR）介导的c-myc反义寡核苷酸（ASODN）对MCF-7细胞端粒酶催化亚单位hTERT基因表达的抑制效应，进一步阐明c-myc对hTERT基因的调控作用，并为针对端粒酶活性抑制的乳腺癌的基因治疗提供理论依据。方法：培养MCF-7细胞，待细胞生长状态良好并达到指数生长期时，根据所购脂质体的厂家推荐剂量，按照每孔脂质体200μl，寡核苷酸500μl的剂量配成转染复合物，加入各孔细胞中。研究设置对照组、LR-SODN组及LR-ASODN组，每组6个复孔。在转染24小时、48小时、72小时后，分别收集各组细胞，用UNIQ柱式TRIZOL提取法提取各组总RNA，按MMLV一步法PCR（略作改进）进行hTERT mRNA表达的检测，紫外凝胶成像分析仪进行凝胶电泳产物的灰度扫描，以hTERT与内对照引物β-肌动蛋白（β-actin）的比值表示hTERT mRNA相对表达量。实验重复5次。数据进行单因素方差分析，α=0.05。结果：1. 1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶电泳分析RNA提取样品显示28S和18S两条清晰带，前者的质量是后者的2倍，表明RNA提取成功，提取样品可用作RT-PCR的扩增模板。 2. RT-PCR扩增产物凝胶电泳分析显示：各组在PUC Mix Marker 145bp处均可见明暗不一的hTERT扩增条带，于540bp处可见明暗一致的β-actin扩增带；3.凝胶灰度扫描以hTERT和内参照引物β-actin的灰度比值表示hTERT mRNA相对表达量。对照组的5组hTERT mRNA相对表达量分别为0.705、 0.713、0.753、0.724和0.733；LR-SODN组24小时的5组hTERT mRNA相对表达量分别为0.704、0.714、0.750、0.724和0.731；48小时的5组hTERT mRNA相对表达量分别为0.703、0.713、0.747、0.726和0.730；72小时的5组hTERT mRNA相对表达量分别为0.699、0.716、0.742、0.719和0.730；LR-ASODN组24小时的5组hTERT mRNA相对表达量分别为0.589、0.612、0.538、0.614和0.701；48小时的5组hTERT mRNA相对表达量分别为0.289、0.218、0.274、0.265和0.254；72小时的5组hTERT mRNA 相对表达量分别为0.148、0.136、0.131、0.159和0.143。单因素方差分析显示，LR-ASODN作用于MCF-7细胞24、48、72小时时hTERT mRNA相对表达量分别与LR-SODN、对照组相比有显著性差异（P <0.01），LR-SODN作用于MCF-7细胞24、48、72小时时hTERT mRNA相对表达量分别与对照组相比无显著性差异（P >0.05）。并且ASODN对MCF-7细胞hTERT基因的抑制效果随时间推移而逐渐升高。结论：1. LR介导的c-myc ASODN能有效抑制MCF-7细胞中端粒酶hTERT mRNA表达水平，且抑制效果随着时间的延长逐渐明显。本研究通过抑制hTERT的促进因素—c-myc来改变hTERT活性，从逆向的角度进一步证明c-myc对hTERT基因表达具有正向调节作用；2. 结合继往c-myc ASODN能有效抑制MCF-7细胞的生长及其c-myc蛋白表达的研究结果，推测其机制为：LR介导c-myc ASODN通过封闭c-myc基因抑制其蛋白表达，下调hTERT基因表达，进而下调端粒酶活性，使细胞生长受到抑制。3. 通过c-myc反义寡核苷酸封闭c-myc基因表达，下调hTERT基因表达水平，降低端粒酶活性，是一条可行性的肿瘤治疗策略。