香鱼(Plecoglossus altivelis)出血症及趋化因子LECT2基因的研究

摘要

本论文以我国重要的淡水养殖鱼类香鱼(Plecoglossus altivelis)为研究对象，采用组织学以及分子克隆技术对2007年浙江宁海凫溪香鱼养殖场爆发的细菌性出血症进行了病原鉴定、对患病香鱼进行组织病理学观察以及克隆了趋化因子LECT2基因，并对LECT2基因的结构组成、器官或组织表达特异性、原核表达等方面的开展了研究。主要研究了以下几个方面：
　　 1.从患出血症的病鱼体腔液分离得到一株ayu-ah0201分离物，通过对该菌的形态、生理生化及16S rDNA序列分析结果表明，其为革兰氏阴性短杆状，极生鞭毛。对蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶呈阳性，鸟氨酸脱羧酶呈阴性。可利用葡萄糖产酸产气。在以该菌16S rDNA序列和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列构建的系统发育树，表明分离菌ayu-ah0201与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）聚在一簇，与嗜水气单胞菌核苷酸序列同源性最高，为99.6％～99.7％，与其它相关气单胞菌属成员的核苷酸序列同源性小于98.9％。结合形态和生理生化特点将其鉴定为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。通过致病性回归试验，发现其有较高的致病性。感染的香鱼均出现与自然发病相同的症状，并从病鱼体内再次分离到理化特性以及16S rDNA序列与原菌株相同的菌株，表明分离物ayu-ah0201能引起香鱼出血症，并可能是此次浙江宁海凫溪香鱼出血病的主要病原之一。
　　 2.对患病香鱼进行血液生化指标分析以及对其眼、肝、脾、肾、肠、鳃、心等器官或组织进行组织学观察以及部分组织电镜观察，发现香鱼鳃、脾脏、肝脏和肠是细菌重要的靶器官，细菌入侵使这些细胞出现肿胀，溶解坏死等炎症表现。病鱼红细胞、血红蛋白数量较健康香鱼显著减少（P<0.05），白细胞显著增加(P<0.05)，血清酶酶类也发生了相应的变化。通过电镜观察发现肝脏组织细胞发生了脂肪变性、水变性，其中线粒体部分发生髓样变性等，严重破坏胞器的正常结构以及自身的生理机能。在患病香鱼脾脏组织中发现大量长约2μm、宽约0.5μm的细菌，脾脏细胞损伤主要表现为线粒体脊消失、溶酶体增多，细胞间隙增大。
　　 3.香鱼LECT2基因cDNA序列全长为565 bp，包含468 bp开放阅读框，编码一个156个氨基酸残基组成的蛋白质（17.0 kDa）。cDNA序列在34～36 nt有典型的ATG起始密码子，其中5’端非翻译区(5’UTR) 长32bp，3’端非编码区长64bp,在529～534nt有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA信号，poly (A) 尾巴出现在AATAAA 信号下游13nt位置。从推导的香鱼LECT2氨基酸序列(156 aa），它是由包括信号肽和前体肽两部分组成，并含有四个半胱氨酸，形成2个二硫键。序列与包括人类在内的其他生物LECT2成熟肽的同源性在47％～77％，其中与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）相似性最高。
　　 4.在患病香鱼肝脏、脾脏、肾脏、心脏、脑、肠道等6种不同器官、组织中均检测到LECT2 mRNA。但各器官、组织中LECT2阳性信号强度差异较明显，其中肝脏信号最强，脾脏和肾脏中较弱些，而心脏、脑、鳃中信号最弱。香鱼在浓度1×106CFU/mL嗜水气单胞菌持续侵染12h，24h，36h条件下，肝脏中LECT2的表达也存在较明显的差异，其表达量与生理盐水对照组相比显著增加，其中在侵染24h的时候表达量到最高，36 h的时候其表达量又有所降低。
　　 5.根据克隆的香鱼LECT2基因的序列，设计了特异性引物，PCR扩增其成熟肽片段。重组至融合表达载体pET-22b中,构建成香鱼LECT2基因融合表达载体pET-22b/ LECT2，转化至大肠杆菌BL21中，筛选得到的阳性克隆用IPTG进行诱导。SDS-PAGE电泳显示在17 kDa处有特异性的蛋白条带出现，Western-blot检测表明已经成功表达了融合蛋白。该实验结果为开展免疫组化实验及进一步研究LECT2的功能等奠定了良好的基础。