基于NASBA技术检测细菌耐药性方法的建立

摘要

目的：产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌在世界各地的爆发威胁着人类的生命健康，而且携带KPC的细菌感染与高死亡率呈正相关。因此及时准确快速的检出产 KPC细菌对预防、控制耐药菌株的流行意义重大。推荐的改良Hodge试验准确性高，但较费时。PCR扩增检测时间大大缩短，但对仪器设备和场所要求较高。核酸序列依赖性扩增NASBA具有操作简便、扩增效率高、特异性强的优点。本研究旨在建立检测KPC耐药的NASBA检测方法，并对该方法进行初步评价。
　　方法：本实验采用依赖KPC转录产物mRNA的NASBA扩增检测KPC耐药。根据Genebank中肺炎克雷伯菌管家基因MDH的保守序列、肠杆菌科细菌耐药基因KPC的保守序列设计NASBA引物，将上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定。同时摸索及优化NASBA反应中各酶浓度、离子浓度、反应温度等条件，分析该方法的灵敏度和特异性。采用该NASBA方法、PCR及逆转录PCR检测临床收集的45株肺炎克雷伯菌，比较结果的一致性。
　　结果：KPC及MDH的NASBA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分别得到249 n t、190nt的特异性条带，并且测序鉴定序列与预计片段序列比对一致。通过摸索及优化NASBA反应中各酶浓度、离子浓度、反应温度等条件建立NASBA扩增体系（24μl）：缓冲液中氯化钾终浓度60mmol/L，氯化镁终浓度14mmol/L，PH8.0 Tris-HCl终浓度40mmol/L，DTT终浓度7.5mmol/L，DMSO终浓度15％；每个引物终浓度0.2μmol/L；d N T P1mmol/L；N T P2mmol/L；酶混合液中T7 R N A聚合酶50 U、AMV逆转录酶10U、RNase H0.5U、BSA0.1mg/ml；反应温度：40℃；反应时间：90min。该NASBA方法能检测到10-3ng/μl的RNA量，较RT-PCR方法多2个数量级，提示该方法比RT-PCR灵敏度高；对照KPC阴性菌株与KPC阳性菌株的NASBA扩增产物电泳分析发现仅KPC阳性菌株出现特异性条带。45株临床收集的肺炎克雷伯菌中32株NASBA扩增阳性，13株NASBA扩增阴性，与药敏、PCR、RT-PCR结果一致，符合率达到100%。
　　结论：NASBA方法检测KPC型碳青霉烯酶耐药简便快速，并且灵敏度和特异性均较高，具有广阔的应用前景。

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引言

第一部分 肺炎克雷伯菌MDH NASBA扩增方法的建立

1材料

1.1菌株

1.2主要仪器及耗材

1.3主要试剂及配制方法

2方法

2.1 NASBA扩增

2.2 NASBA扩增产物的鉴定

2.3 NASBA扩增条件的优化

3结果

3.1琼脂糖凝胶电泳鉴定NASBA扩增产物

3.2 NASBA扩增产物测序、分析

3.3 NASBA扩增反应条件的优化

4小结与讨论

4.1初步建立NASBA扩增方法

4.2 NASBA检测方法的建立

4.3 NASBA反应条件对扩增效率的影响

4.4 NASBA的优势

第二部分 肺炎克雷伯菌KPC的PCR检测及RT-PCR检测

1材料

1.1菌株

1.2主要仪器及耗材

1.3主要试剂

2方法

2.1药敏分析判断标准

2.2 PCR引物设计

2.3培养基的制备

2.4 DNA提取

2.5 PCR检测

2.6 RNA提取

2.7 RT-PCR检测

2.8特异性检测

2.9灵敏度检测

3结果

3.1 药敏分析结果

3.2 KPC PCR扩增结果

3.3 KPC RT-PCR特异性检测

3.4 KPC RT-PCR灵敏度检测

3.5 KPC RT-PCR扩增结果

4小结与讨论

第三部分 肺炎克雷伯菌KPC NASBA检测方法的评价与初步应用

1材料

1.1菌株

1.2主要仪器及耗材

1.3主要试剂

1.4 NASBA扩增引物设计

2方法

2.1 NASBA扩增产物核苷酸测序、分析

2.2 MDH基因灵敏度及特异性实验

2.3 KPC基因灵敏度及特异性实验

2.4 NASBA方法的临床初步应用

2.5统计学分析

3结果

3.1 NASBA扩增产物核苷酸测序、分析

3.2 MDH基因灵敏度及特异性实验

3.3 KPC基因灵敏度及特异性实验

3.4 NASBA方法的临床初步应用

4小结与讨论

结论

参考文献

附录A NASBA技术在致病菌检测中的应用

在学研究成果

致谢