刺参腐皮综合症相关microRNA调控机制初探

摘要

腐皮综合症是刺参（Apostichopus japonicus）养殖中最常见的疾病之一，已成为制约刺参养殖行业稳定发展的主要限制因素。目前，多种病原已在不同地区发病刺参中被分离获得，但对于不同病原感染刺参过程中的腐皮综合症发生机制的研究却知之甚少。microRNA（miRNA）是一类内源性的具有调控功能的非编码小 RNA，能够在转录后水平上抑制 mRNA翻译或诱导 mRNA降解，从而在免疫反应调控中发挥重要作用，是研究宿主与病原互作的重要调节因子。
　　本文立足于刺参腐皮综合症关键调控 miRNA分子，应用高通量的RNA-seq手段与iTRAQ蛋白质组技术，筛选其靶基因，同时应用生物信息学分析与双荧光素酶报告系统，验证 miRNA与其靶基因具有调控关系，以腐皮综合症病原之一灿烂弧菌（Vibrio splendidus）作为模拟病原，在细胞及个体水平上对miRNAs在宿主与病原互作中进行功能解析，以期为刺参腐皮综合症的分子治疗提供理论基础。研究成果如下：
　　（1）构建了腐皮综合症发生前后刺参体腔细胞的均一化 cDNA文库和数字表达基因文库，高通量测序和生物信息学分析获得了4,858个差异表达基因，其中上调表达基因2,163个，下调表达基因2,695个。从中识别了包括 miR-2008、miR-137以及miR-92a等在内的miRNA的靶基因；
　　（2）发展了杂交PCR筛选miR-92a靶基因的新体系，成功注释了miR-92a的潜在靶基因10个，结合RNA-seq获得的23个miR-92a靶基因，从中发现了SMURF、MEGF和PCBP等三个共同靶基因。探究了在灿烂弧菌以及LPS胁迫下，刺参miR-92a及其预测靶基因的的体内和体外表达模式变化，进一步确认了MEGF及SMURF作为miR-92a的靶基因的可能性。
　　（3）完成了iTRAQ基础上的病原灿烂弧菌感染刺参过程中的体腔细胞全蛋白组的定量分析，成功注释了相关表达蛋白2,049个（FDR<1.0％），筛选出差异表达蛋白228个，其中129个蛋白下调表达，融合转录组数据，识别了miR-2008靶蛋白8个，miR-137的靶蛋白9个；
　　（4）建立了刺参个体和体外培养细胞两个层次上的miRNA和靶基因功能鉴定体系，系统阐明了刺参 miR-137和miR-2008分化靶向甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）介导细胞 ROS产生抵御病原微生物感染的新机制。通过双荧光素酶报告系统鉴定了BHMT3’UTR中miR-137和miR-2008各具一个功能结合位点。结合定量PCR与Western blot以及菌落计数和流式细胞仪分析，确定了miR-137诱导BHMT mRNA降解，而miR-2008则在翻译水平调控BHMT蛋白水平，进而影响胞内Hcy水平，调控胞内ROS产生和降低胞内细菌存活率的分子途径。

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引言

第一章 绪论

1 microRNA概述

2仿刺参腐皮综合症研究进展

3立题背景

第二章 基于RNA-seq的刺参腐皮综合症相关miRNA靶基因识别

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第三章 灿烂弧菌及LPS胁迫下miR-92a及其预测靶基因表达分析

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第四章 基于iTRAQ的刺参腐皮综合症相关miRNA靶基因识别

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第五章 miR-137，miR-2008调控BHMT促进ROS产生

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

第六章 论文创新点及工作展望

1创新点

2展望

参考文献

在学研究成果

致谢