水产活饵料蚤状溞(Daphnia pulex)的培养及生殖转化功能的研究

摘要

本文以蚤状溞（Daphnia pulex）为研究对象，通过温度及密度实验，优化蚤状溞的培养条件，利用生产性和实验室培养相结合的途径，获得了孤雌溞、两性溞、雄溞、幼溞、卵鞍等不同生殖状态的实验材料。然后采用同源克隆和RACE-PCR的方法，克隆了蚤状溞 transformer(Dptra)基因 cDNA全长，采用Real-Time PCR技术分析了不同生殖状态下的蚤状溞的tra mRNA表达水平，用原位杂交技术对 tra基因进行表达定位，并用 RNA干扰技术干扰 Dptra mRNA的表达，用 Real-Time PCR和Western blot技术分析 tra在干扰前后基因和蛋白水平的表达变化。该研究不仅有利于阐明 tra基因在蚤状溞的性别决定与生殖转化中的调控作用，而且为研究枝角类的生殖转化提供理论依据和参考。研究结果如下：
　　（1）不同温度对蚤状溞的培养呈现出不同的效应，25℃是蚤状溞的最适生长温度，而且在15-25℃温度范围，平均每个亲溞每天产仔数是是随温度升高而升高的，而产休眠卵数是随温度升高而下降的，雄体数比率也下降。33℃时产仔数最少，而雄体比率最高。每个蚤状溞的平均生殖量随种群密度的增加而下降，种群密度梯度为5、10、20和40个/50ml时，每个蚤状溞的平均生殖量分别为95.23、60.14、32.80和21.00个。在种群密度为10、20、40个/50ml时，出现雄体，平均每个蚤状溞产雄体的比率分别为0.89、1.76、2.33，同时也出现了休眠卵，每个蚤状溞平均产休眠卵分别为9.75、23.76、35.20。
　　（2）用 RACE技术克隆了tra基因 cDNA全长为1652bp，开放阅读框（ORF）为1158bp，编码385个氨基酸残基，含有 SDP_N结构域，甘氨酸富集区Glycine-rich region。同源性比对结果显示蚤状溞 Dptra与大型溞（D.magna）的同源性最高为81％，其次是昆虫纲的意蜂（A.mellifera）53%，中华蜜蜂（A.cerana）51%等；进化分析发现蚤状溞 Dptra与大型溞，意蜂，印度跳蚁等亲缘关系最近。
　　（3）利用 Realtime-PCR和整体原位杂交技术对 tra基因在不同溞体中表达进行定量和定位，定量结果表明，Dptra在雄溞中表达量最高，其次为两性溞和孤雌溞，在幼年雌溞和卵鞍中表达量较低。表明 Dptra不仅具有性别差异性，而且不同生殖状态也有明显差异性，两性生殖状态下 tra表达水平显著高于孤雌生殖(P<0.05)。定位结果显示雌雄溞体中 Dptra基因表达量不同，Dptra基因在雄溞的第一触角第二触角和第一胸肢阳性信号明显较强于孤雌溞和两性溞。说明Dptra基因很有可能在蚤状溞生殖转换和性别分化过程上发挥重要作用。
　　（4）构建原核表达载体 pET-28a-Dptra。诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE电泳分析重组蛋白条带约46kDa，与预期的分子量基本一致。以重组蛋白为抗原制备了tra基因的多克隆抗体，其效价为10000。重组蛋白与 Dptra多克隆抗体结合的免疫印迹鉴定显示1:2000稀释的Dptra抗体能够特异性地识别重组蛋白。
　　（5）通过构建并使用 dsRNA表达载体，体外转录合成 Dptra dsRNA，通过浸泡 Dptra基因的dsRNA对不同生殖状态蚤状溞 tra基因进行干扰，RT-PCR检测RNAi后tra mRNA表达量，在干扰16h后，不同生殖状态下干扰组与对照组比较 tra基因表达量都有明显下调（P<0.05）。应用 Western-blot检测 RNA干扰后对 TRA蛋白表达的影响，Western blot显示干扰前后TRA蛋白的表达水平明显受到抑制。实验结果说明体外转录合成的dsRNA能有效抑制 TRA蛋白的表达，降低 tra mRNA的水平，对 tra有高效和特异的沉默作用。

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引言

1绪论

1.1关于枝角类生殖发育生物学方面的研究

1.2 transformer (tra)的研究概况

1.3 RNA整体原位杂交技术

1.4 RNA干扰技术及其应用

1.5 Western blot技术

1.6本文的研究目的和意义

2温度和种群密度对蚤状溞生殖的影响

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4本章小结

3蚤状溞transformer基因全长cDNA的克隆

3.1实验材料和主要仪器

3.2实验方法

3.3实验结果与分析

3.4讨论

3.5本章小结

4整体原位杂交定位Dptra的表达位点

4.1实验材料

4.2主要试剂

4.3主要仪器

4.4试验方法

4.5实验结果与分析

4.6讨论

4.7本章小结

5 RNA干扰Dptra基因的表达研究

5.1实验材料和主要仪器

5.2实验方法

5.3实验结果与分析

5.4讨论

5.5本章小结

6蚤状溞tra的原核表达及多克隆抗体制备及应用

6.1实验材料与方法

6.2实验结果

6.3讨论

6.4本章小结

7 结论与创新点

7.1 结论

7.2 创新点

参考文献

在 学 研 究 成 果

致谢