东莨菪碱对斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠抑郁样行为的作用及机制研究

摘要

目的：抑郁症的发生与胆碱能系统的异常紧密相关。长期以来不断有研究人员尝试通过改变胆碱能系统活动来逆转人或动物的抑郁症状。国内外研究已经证实胆碱能神经元损伤会损害认知功能，并伴有抑郁样行为。而最近的研究发现，在抑郁症患者中静注毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂东莨菪碱4.0μg/kg可以发挥快速、强劲且持续的抗抑郁作用，但东莨菪碱抗抑郁的神经生物学机制仍不清楚。本研究通过特异性毁损大鼠斜角带核胆碱能神经元，诱导抑郁样行为，观察东莨菪碱对斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠抑郁样行为的作用，以期阐明东莨菪碱与抑郁症之间相互作用的中枢位点及神经生物学机制。
　　实验一：特异性毁损斜角带核胆碱能神经元对大鼠抑郁样行为的影响
　　方法：成年雄性 SD大鼠随机分成三组：空白对照组（Control，n=6），假手术组（SHAM，n=6），神经免疫毒素皂草素（192IgG-Saporin）组（192IgG，n=6）。 SHAM组和192IgG组大鼠立体定位，分别在斜角带核（AP:+0.48mm,ML:±0.8mm,DV:-8.0mm）微注射0.5μl/侧核团的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin，2周后所有大鼠进行糖水偏好（Sucrose preference test，SPT）、旷场实验（open field test，OFT）、自发活动（locomotor activity）、强迫游泳（forced swimming test，FST），最后处死大鼠取脑组织进行 H&E染色，并通过免疫荧光染色（immunofluorescence，IF）检测 ChAt阳性细胞数。
　　结果：H&E染色显示，与 SHAM组相比，192IgG组在海马中细胞数层数减少，同样 IF结果显示192IgG组斜角带核中的ChAT阳性细胞数显著降低（P<0.01）。行为学 SPT、OFT、FST和 Locomotor activity测试中发现，特异性毁损斜角带核胆碱能神经元能显著降低大鼠对糖水的偏好（P<0.05），延长大鼠强迫游泳的不动时间（P<0.01），并显著减少大鼠的活动度（P<0.01），而SHAM组与 Control组大鼠则无明显统计学差异，说明特异性毁损斜角带核胆碱能神经元会使大鼠产生抑郁样行为。
　　实验二：东莨菪碱对斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠抑郁样行为的影响
　　方法：成年雄性 SD大鼠随机分成四组：假手术组（SHAM，n=6），生理盐水对照组（Vehicle，n=6），东莨菪碱25μg/kg组（Scopolamine25μg/kg，n=6），东莨菪碱50μg/kg组（Scopolamine50μg/kg，n=6）。SHAM组和其余组大鼠立体定位，分别在斜角带核微注射0.5μl/侧核团的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin。2周后，除 SHAM组大鼠外，其余组分别在每次测试前1小时腹腔注射生理盐水和东莨菪碱（25μg/kg及50μg/kg），然后所有大鼠在第16、18、20、22及24天依次进行 SPT、OFT、EMP、Locomotor activity和 FST。行为学实验结束后处死大鼠取脑组织进行 Nissl染色，IHC检测 BDNF阳性细胞数及Western blot检测 pERK、 ERK、pCREB、CREB、BDNF、pAKT和 AKT蛋白表达水平。
　　结果：1、行为学测试：根据糖水偏好实验结果，与 Vehicle组相比，25μg/kg东莨菪碱处理组大鼠对糖水的偏好明显增加（P<0.01）;在 OFT中，4组大鼠的穿线次数无统计学差异（P＞0.05），但25μg/k g东莨菪碱处理组大鼠的直立次数显著高于 Vehicle组（P<0.05）；在 EMP中，斜角带核胆碱能神经元损伤的3组大鼠开放臂停留时间百分比之间差异无统计学差异（P＞0.05）；在Locomotor activity中，25μg/kg东莨菪碱处理组大鼠的活动距离均较 Vehicle组明显增加（P<0.05）；在 FST中，25μg/kg东莨菪碱处理组大鼠的不动时间百分比均较 Vehicle组缩短（P<0.01）；所有测试中50μg/kg东莨菪碱处理组大鼠与Vehicle组相比均无统计学意义（P＞0.05）。
　　2、Nissl染色：25μg/kg东莨菪碱处理组大鼠海马细胞层数多于 Vehicle组。
　　3、IHC：与 Vehicle组相比，25μg/kg东莨菪碱处理组大鼠海马 CA3区脑源性神经营养因子（B D N F）阳性细胞数显著增加（P<0.05）。
　　4、Western blot：与 Vehicle组相比，25μg/kg东莨菪碱能明显增加斜角带核胆碱能神经损伤大鼠海马 pERK、pCREB、BDNF及 pAKT蛋白表达（P<0.05）。
　　实验三：东莨菪碱及选择性 M1受体拮抗剂对斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠抑郁样行为的影响
　　方法：成年雄性 SD大鼠随机分成五组：假手术组（SHAM，n=6），生理盐水对照组（Vehicle，n=6），东莨菪碱组（Scopolamine，n=6），替仑西平组（Telezepine，n=6），比哌立登组（Biperiden，n=6）。SHAM组和其余组大鼠立体定位，分别在斜角带核微注射0.5μl/侧核团的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin。2周后，除 SHAM组大鼠外，其余组分别在每次测试前1小时腹腔注射生理盐水、东莨菪碱25μg/kg和比哌立登1mg/kg，皮下注射替仑西平3mg/kg，然后所有大鼠在第16、18、20、22及24天依次进行 SPT、OFT、EMP、Locomotor activity和 FST。行为学结束后处死大鼠取脑组织进行 Western blot检测 pERK、ERK、pCREB、CREB、BDNF、pAKT及 AKT蛋白表达水平。
　　结果：1、行为学测试：根据 FST结果，与 Vehicle组相比，东莨菪碱组、替仑西平组和比哌立登组大鼠对糖水的偏好明显增加（P<0.01）;在 OFT中，5组大鼠的穿线次数无统计学差异（P＞0.05），但东莨菪碱组和比哌立登组大鼠的直立次数显著高于 Vehicle组（P<0.05）；在 EMP中，5组大鼠开放臂停留时间百分比之间差异无统计学差异（P＞0.05）；在 Locomotor activity中，5组大鼠的活动距离无显著性差异（P<0.05）；在 F S T中，东莨菪碱组、替仑西平组和比哌立登组大鼠的不动时间百分比均较 Vehicle组缩短（P<0.001，P<0.05，P<0.01）。
　　2、Western blot：与 Vehicle组相比，东莨菪碱、替仑西平和比哌立登能明显增加斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠海马 pERK、pCREB、BDNF及 pAKT蛋白表达（P<0.05）。
　　实验四：东莨菪碱对斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠海马齿状回5-HIAA释放的影响
　　方法：成年雄性 SD大鼠随机分成五组：空白对照组（Control，n=15），生理盐水对照组（Vehicle，n=3），东莨菪碱组（Scopolamine，n=3），替仑西平组（Telezepine，n=3），比哌立登组（Biperiden，n=3），氯胺酮组（Ketamine，n=3）,丁螺环酮组（buspirone，n=3），Control组和其余组大鼠立体定位，分别在斜角带核微注射0.5μl/侧核团的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin。2周后所有大鼠以海马齿状回（DG）（AP-3.8mm,ML-1.6mm,DV-2.0mm）为靶点埋置微透析探针套管。恢复7天，通过套管植入微透析探针。人工脑脊液(aCSF145 mM NaCl,2.8 mM KCl,1.2 mM MgCl2,1.2 mMCaCl2,5.4 mM glucose，pH7.2)以1μl/min的流速灌流，高效液相色谱（HPLC）检测5-HIAA含量。2小时后，分别腹腔注射生理盐水、东莨菪碱25μg/kg、比哌立登1mg/kg、氯胺酮10mg/kg和丁螺环酮10mg/kg，皮下注射替仑西平3mg/kg。Control组各取3只与给药组同等给药，Vehicle组注射等量生理盐水。
　　结果：与 Vehicle组相比，东莨菪碱、替仑西平、比哌立登和氯胺酮能明显增加斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠海马 DG5-HIAA的释放（P<0.05），而除氯胺酮外，均不能显著改变大鼠海马 DG5-HIAA的释放（P＞0.05），氯胺酮能显著增加正常大鼠海马 DG5-HIAA的释放（P<0.01），丁螺环酮对斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠和正常大鼠海马 D G5-H I A A释放无影响（P＞0.05）。
　　结论：本研究证实特异性毁损斜角带核胆碱能神经元显著诱导大鼠抑郁样行为，而这种抑郁样行为可被东莨菪碱和选择性 M1受体拮抗剂所逆转，表明东莨菪碱能改善斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠抑郁样行为及潜在的抗抑郁机制可能是通过抑制突触后 M1受体，进而激活 ERK/CREB/BDNF通路，增加BDNF的释放，改善抑郁情绪。此外，结果还显示东莨菪碱、选择性 M1受体拮抗剂与快速起效抗抑郁药氯胺酮，均能增加斜角带核胆碱能神经元损伤大鼠海马齿状回5-HIAA的释放，间接提示5-HT释放增多，可能是东莨菪碱与氯胺酮抗抑郁作用潜在机制之一，对快速起效药治疗抑郁症的机制研究有重要意义。