鲈鱼(Lateolabrax japonicus)CD3基因的克隆及其诱导表达

摘要

CD3分子表达于T细胞表面，并通过非共价键与T细胞受体（T cell receptor，TCR）连接，参与T细胞活化。ZAP-70分子通过 SH2结构域与信号分子结合，影响着 TCR/CD3介导的信号转导途径。研究内容包括：采用反转录 PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术从鲈鱼（Lateolabrax japonicus）肝脏中克隆了CD3γ/δ、CD3ε、CD3ζ和ZAP-70基因cDNA全长；利用qRT-PCR技术检测了鲈鱼CD3基因组织分布及感染哈维氏弧菌后 CD3γ/δ、CD3ε、CD3ζ的表达变化；体外培养鲈鱼头肾白细胞，利用qRT-PCR技术检测了LPS和PHA处理后，白细胞中CD3γ/δ、CD3ε、CD3ζ和ZAP-70基因的表达变化。
　　本研究主要内容包括：⑴基因序列分析结果显示，CD3γ/δ全长cDNA为1231 bp，包括99 bp的5’非翻译区（untranslated regions，UTR），583 bp的3’UTR和549 bp的开放阅读框（open reading frame，ORF），共编码182个氨基酸；CD3ε全长 cDNA为2145 bp，包括186 bp的5’UTR，1434 bp的3’UTR和525 bp的ORF，共编码174个氨基酸；CD3ζ全长1281 bp，包括56 bp的5’UTR，772 bp的3’UTR和453 bp的ORF，共编码150个氨基酸。ZAP-70 cDNA全长2396 bp，其中5'-UTR为127 bp，3'-UTR为429 bp，ORF为1830 bp，编码609个氨基酸。氨基酸序列分析发现，CD3γ/δ和CD3ε分子结构相似，均含有1个免疫球蛋白样结构的胞外区、1个跨膜区和含1个ITAM序列的胞浆区，而CD3ζ含有1个仅由5个氨基酸组成的胞外区、1个跨膜区和含3个ITAM序列的胞浆区。ZAP-70分子含有2个SH2结构域和一个SH1结构域，在SH1结构域含有核苷酸结合区域（GxGxxG(x)18K）和该蛋白酪氨酸激酶基序（VHRDLAARNV），及活化环。⑵荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，CD3γ/δ、CD3ε和CD3ζ在鳃、脾、肾、肠中表达较高，在脂肪、肝、眼、脑等组织中表达较少。当腹腔注射哈维氏弧菌3h后，脾组织的CD3γ/δ、CD3ε、CD3ζ基因的表达均显著上调（P<0.05）；CD3γ/δ、CD3ε在肠和肾也显著上调（P<0.05）；12 h后CD3γ/δ、CD3ε、CD3ζ在鳃、脾、肾、肠中表达均下降并趋于平衡。⑶分离鲈鱼头肾白细胞，用LPS（50 mg/L）和PHA（50 mg/L）处理，孵育3 h后白细胞中 CD3γ/δ、CD3ε显著增加（P<0.05），CD3ζ的表达也高于对照组；6 h后CD3γ/δ、CD3ε和CD3ζ的表达降低；12h后CD3γ/δ、CD3ε表达显著性减少，而CD3ζ的表达趋于平衡。ZAP-70的表达在 LPS刺激后一直降低趋势，当用PHA刺激时，ZAP-70的表达会出现短暂的上升后显著降低（P<0.05）。

目录

声明

引言

1综述

1.1 CD3的结构

1.2 CD3的功能

1.3 CD3基因在鱼类中研究进展

1.4研究目的和意义

2鲈鱼CD3基因的克隆

2.1实验材料与仪器

2.2实验方法

2.3实验结果和分析

2.4讨论

3鲈鱼ZAP-70基因的克隆

3.1实验材料和仪器

3.2试验方法

3.3实验结果与分析

3.4讨论

4鲈鱼CD3基因组织表达及CD3应对哈维氏弧菌感染表达分析

4.1实验材料与仪器

4.2试验方法

4.3结果分析

4.4讨论

5 CD3和ZAP-70基因体外表达

5.1实验材料与仪器

5.2试验方法

5.3实验结果

5.4讨论

参考文献

在学研究成果

致谢