山羊内皮祖细胞和人脐静脉内皮细胞的体外培养及eNOS cDNA的克隆

摘要

目的:通过对山羊内皮祖细胞和人脐静脉内皮细胞的体外培养，以及eNOS cDNA的克隆鉴定，为以后下一步试验打下基础方法:1.采集山羊外周血，磷酸盐缓冲液(PBS)等比稀释后，将淋巴细胞分离液和稀释血以2:3的比例依次加入离心管中，在水平离心机中以离心力400g，时间20分钟密度梯度离心分离单个核细胞。将分离出的单核细胞洗涤两次后，重悬细胞，显微镜下计数，调整细胞密度后将细胞接种于培养瓶，用含20％胎牛血清、10ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)诱导培养。在光学显微镜下观察细胞生长情况，并对培养2周的细胞采用使用免疫荧光染色的方法鉴CD133 2.产后新鲜脐带，无菌剪取10-15厘米长一段，吸取温PBS液注入脐静脉中沈去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.2％的胰酶，充满血管，消化10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层，在光学显微镜下观察细胞生长情况，并使用免疫组化的方法鉴CD31 3.根据基因文库报道的eNOS cDNA序列合成引物分段扩增全编码区，所得片段标记P12和P34,并在P12两端分别加上限制性内切酶Ecorl和Kpn I酶切位点。P34两端分别加上限制性内切酶Kpn 1和Xba I酶切位点，经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，回收、纯化目的片段。利用T4 DNA连接酶将目的片段连接到pUCm-T载体中。重组质粒转化大肠杆菌，挑取单个克隆，提取质粒重组质粒DNA，电泳初步鉴定构建重组质粒成功。结果:1.得到山羊内皮祖细胞和人脐静脉内皮细胞，并成功鉴定2.成功构建pUCm-T/P12.pUCm-T/P34 结论:本试验为后续试验打下基础，pcDNA3.0/eNOS真核表达载体的构建及pcDNA3.0/eNOS质粒在内皮祖细胞中的表达是下一步的试验方向

目录

论文说明：中英文缩词对照表

声明

摘要

前言

细胞培养的材料.仪器和方法

结果

eNOS cDNA的克隆及鉴定

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

内皮祖细胞与冠心病(综述)