重要根结线虫等温扩增碟式芯片的研发

摘要

根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物病原线虫中分布最广、危害最严重的类群之一，几乎能侵染绝大部分高等植物。在我国，根结线虫(非中国种)已被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，建立快速有效的检测方法对于防止外来物种进入我国有重要意义。本研究将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合，同时分别以山茶根结线虫(M.camelliae)和苹果根结线虫(M.mali)核糖体DNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标，建立了两种LAMP-LFD新技术，分别可于25min和45min内特异性地检出目标种。其针对山茶根结线虫和苹果根结线虫基因组DNA的灵敏度分别可达4pg/μL和1pg/μL，针对单条2龄幼虫的检测灵敏度为1/1000条2龄幼虫基因组DNA。在此基础上结合已经公布的象耳豆根结线虫(M.enterolobii)检测体系，确立了LAMP反应的统一体系和反应条件，据此筛选北方根结线虫(M.hapla)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和南方根结线虫(M.incongnita)的最佳引物组合。继而将LAMP技术与微流体芯片技术相结合，建立了可同时检测山茶根结线虫等7种根结线虫的等温扩增微流体芯片检测技术。利用该技术只需一次加样，即可在1h内完成7个指标的同步检测及结果判读，其针对目标种基因组DNA的检测灵敏度可达0.18～18.2pg/μL，针对单条2龄幼虫的检测灵敏度为1/100～1/1000条根结线虫的基因组DNA。实际样本检测结果表明，与传统的形态学检测相比，该方法的临床敏感性及临床特异性分别为93.75％和94.74%。本研究建立的重要根结线虫等温扩增碟式芯片检测体系对样本和试剂消耗少，操作简单，可实时同步检测7个病原指标，因此有望在各个基层的检验检疫机构中普及使用。

目录

声明

引言

1.1根结线虫的研究背景

1.2 根结线虫的种类鉴定和检测方法

1.3 研究目的及意义

2山茶根结线虫快速检测方法的建立

2.1 材料与方法

2.2结果

2.3 讨论

2.4 小结

3苹果根结线虫快速检测方法的建立

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3讨论

3.4 小结

4重要根结线虫等温扩增芯片检测体系的建立

4.1 材料与方法

4.2结果

4.3 讨论

4.4 小结

5结语

5.1取得成果

5.2创新点

5.3 展望

参考文献

在 学 研 究 成 果

致谢