基于血红蛋白源多肽的泥蚶抗菌机制的初步研究

摘要

泥蚶（Tegillarca granosa）主要分布于我国东南沿海地区，是我国传统四大经济养殖贝类之一，同时它又是一类较为特殊的血液中富含血红蛋白的双壳贝类。前期课题组已经成功地克隆出了泥蚶血红蛋白的3种基因分别命名为Tg-HbI、Tg-HbIIA和Tg-HbIIB，其中Tg-HbI基因编码翻译形成血红蛋白同源二聚体，Tg-HbIIA和Tg-HbIIB基因编码翻译形成血红蛋白异源四聚体，并从分子和蛋白水平研究发现血红蛋白具有较强的抗菌免疫活性，进一步研究还发现血红蛋白利用其过氧化物酶活性产生ROS来发挥杀菌作用。为进一步研究泥蚶血红蛋白的抗菌免疫机制，本研究从血红蛋白源多肽的抗菌活性入手，研究了血红蛋白酶解多肽的抗菌活性和泥蚶攻毒前后血浆中血红蛋白源多肽含量的变化，为泥蚶血红蛋白抗菌机制的研究奠定基础。
　　本研究利用凝胶层析技术分离纯化获得Tg-HbI和Tg-HbII，回收率分别约为25％和48%左右。胰蛋白酶分别酶解Tg-HbI和Tg-HbII，采用反相C-18柱对酶解液进行分离纯化，从Tg-HbI酶解液中纯化出了四种多肽分别命名为 HbI-1、HbI-2、HbI-3和HbI-4，Tg-HbII酶解液中分离得到7种含量较高的多肽分别命名为HbII-1、HbII-2、HbII-3、HbII-4、HbII-5、HbII-6和HbII-7。通过琼脂扩散法测试了11种酶解多肽对革兰氏阴性菌大肠杆菌、恶臭假单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌以及革兰氏阳性菌坚强芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，结果显示，多肽HbI-2和HbI-3对坚强芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和溶藻弧菌具有抗菌效果，多肽HbI-4对所有指示菌均有抗菌活性，HbII-2、HbII-3、HbII-4、HBII-5、HbII-6和HbII-7对三种弧菌具有较强的抗菌活性。同时利用96孔板对倍稀释法测得多肽对这几种菌的MIC范围为1.44×10-3~3.69×10-2mg/mL。为进一步研究抗菌肽作用效果和杀菌机理，采用荧光显微镜观察多肽杀菌效果，发现抗菌肽杀菌迅速，数分钟之内就能将细菌杀死；利用扫描电子显微镜观察抗菌肽作用不同时间下的溶藻弧菌细胞，透射电子显微镜观察抗菌肽处理后的溶藻弧菌和哈维氏弧菌细胞的超微结构，发现抗菌肽通过增加细胞质膜通透性，致使细胞内的物质外流使细胞代谢受阻而发挥杀菌作用的。用副溶血弧菌对泥蚶进行菌刺激试验，分别取刺激0h、3h和24h的泥蚶血浆做多肽组分析，结果发现泥蚶血浆中来源于血红蛋白的多肽共有89种，其中有82种多肽来源于Tg-HbI，极少数的多肽来源于Tg-HbII，来源于Tg-HbIIA的血红蛋白源肽段 AALVAVVQAAL与血红蛋白异源四聚体酶解后产生的HbII-6相一致，肽段LVAVVQAAL与Tg-HbI酶解产生的HbI-2一致，HbI-2和HbII-6均具有较强的抗菌活性，经弧菌刺激3h后泥蚶血浆中血红蛋白源多肽变化不明显，但24h后血浆中大部分血红蛋白源多肽含量成倍增加，表明泥蚶在病原微生物入侵后，血红蛋白可能通过酶解产生多种抗菌肽来杀灭致病菌，下一步需要分离纯化体内的天然血红蛋白源抗菌肽，进一步证实该抗菌机制的存在。

目录

声明

引言

1文献综述

1.1 无脊椎动物的先天免疫

1.2 血红蛋白的研究进展

1.3 抗菌肽来源的研究进展

1.4 本研究的目的和意义

2 Tg-Hb酶解多肽的分离纯化

2.1材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

3 Tg-Hb酶解多肽的抗菌活性研究

3.1 材料和方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

4 Tg-Hb酶解多肽抗菌机理研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

5 泥蚶血浆中天然多肽组分析

5.1 实验用品

5.2 实验方法

5.3 结果

5.4 讨论

6 总结

参考文献

在 学 研 究 成 果

致谢