急性癫痫大鼠海马CA3区bcl-2、Caspase-3的表达及其超微结构改变

摘要

目的：探讨急性癫痫脑损伤对大鼠海马CA3区神经元形态学改变的影响。bcl-2、Caspase-3蛋白在不同时间点的表达变化、超微结构的改变，了解bcl-2、Caspase-3蛋白、线粒体、细胞核的改变与癫痫脑损伤的关系。 方法：成年雄性SD大鼠44只随机分为对照组、模型组，模型组又分为3h、6h、24h组，每组11只。模型组作马桑内酯侧脑室微量注射(50μg/kg体重)；对照组大鼠给予侧脑室注射同等剂量的生理盐水，于注射后6h取材。凡癫痫持续时间未达到预定要求或中途死亡的大鼠从本实验中排除。癫痫发作程度参照Racine(0～V级)评级标准，达到Ⅲ级改变以上定为癫痫发作，痫性发作持续超过30 min为致痫成功。模型组各组均观察到癫痫发作Ⅳ级及其以上，致痫成功，对照组未见发作。所有动物在相应时间点经常规灌注固定、取材和制片(石蜡切片、超薄切片)，进行HE染色、免疫组化染色和电镜观察，结果经SPSS13.0软件系统统计分析。 结果： 1．对照组大鼠海马CA3区神经元呈带状分布，数量较多，排列整齐，锥体细胞体积较大，核大而圆，位于细胞中央，染为淡蓝色；核仁、核膜清晰，胞质均匀，形态接近正常；模型3h组海马CA3区神经元形态与对照组相似；模型6h组锥体细胞大部分呈圆形或椭圆形，其间夹杂有少量三角形或不规则形的细胞；模型24h组细胞排列紊乱，胞体收缩呈三角形或极不规则，胞浆红染以及胞核固缩，结构不清，细胞丢失明显。 2．bcl-2蛋白着色于细胞质，在对照组大鼠海马CA3区的锥体细胞层中，bcl-2蛋白有一定量的基础表达，呈弧形条带分布，细胞多为圆形或类圆形，大小较一致，呈棕黄色；与对照组相比，模型3h组大鼠bcl-2蛋白免疫反应产物的染色强度(IOD值)升高、阳性细胞数增多(P<0.05)；与对照组和模型3h组相比，模型6h组大鼠bcl-2蛋白在CA3区锥体神经元的IOD值显著增加、阳性细胞数亦明显升高(P<0.05)；模型24组小时bcl-2蛋白的免疫反应产物的IOD值及阳性神经元数均较模型6h组降低(P<0.05)，但此时亦高于对照组(P<0.05)。 3.Caspase-3的免疫组化染色多在胞浆或胞核，对照组组中Caspase-3的阳性神经元数很少，IOD值较小，多为胞浆着色；模型3h组的Caspase-3的阳性免疫反应产物与对照组相比，IOD值、阳性细胞数变化不是很明显(P>0.05)；随着时间的延长，多转为胞核着色，模型6h组免疫反应产物的染色较深、阳性细胞数较多，与模型3h、对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；模型组24h中的IOD值及阳性神经元细胞数均高于其他各组，此时亦为明显的胞核着色，差异显著(P<0.05)。 4.电镜下对照组大鼠海马内神经元形态正常，核及核膜、线粒体结构清晰、完整；模型3h组在致痫后有不同程度的损伤，表现为间隙肿胀(特别是嵴部分)，严重者伴线粒体膜崩解，模型6h组及24h组线粒体的损伤与模型3h组相似；细胞核的改变不是很明显，仅在模型24h组观察到核膜的溶解。 结论： 1.癫痫发作6h时，bc1-2蛋白在海马CA3区表达增强，说明癫痫发作时，bc1-2的表达增加是机体的一种内源性的抗凋亡机制被活化；24h时表达强度降低，但高于对照组，提示这种保护机制是有限的； 2.Caspase-3在癫痫后神经元损伤过程中发挥重要作用； 3.线粒体的损伤可能是癫痫发作后神经元损伤的关键性环节； 4.模型24h组神经元的细胞核核膜出现了溶解，提示此时细胞核出现了损伤，这与HE染色结果相符；而Caspase-3的高表达早于细胞核改变的时间，可见Caspase-3活性检测比较凋亡的其它形态学检测更能较早地监测出凋亡，为治疗性的凋亡干预提供更为准确的时间窗；也为判断SE后凋亡干预措施是否有效提供了可靠的观察指标。

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综述：褪黑素对癫痫脑损伤神经保护作用的研究进展

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