基于适配体的电化学生物传感器用于同时检测食物中多种有害物质

摘要

本论文基于电化学方波溶出伏安法原理，开发了一系列基于适配体的金属编码复合探针和信号增强策略用于多元电化学分析方法的构建，这些方法方便快捷、成本低，且灵敏度高、特异性好，可同时检测食品中多种有害物质(如多氯联苯，抗生素等)。电化学多元分析法是在单一检测法的基础上发展而来的分析方法，该方法可根据不同金属的溶出峰电位不同，对多种目标物进行区分和定量，单次操作即可达到同时测定多种目标物的目的。适配体是一段经体外筛选得到的 DNA或RNA序列,能特异性结合相应的配体,由于其特异性好、易合成、应用范围广等优点，在生物诊断、环境监测和食品安全研究等领域多有涉及。在本论文中，我们磁性纳米粒子(Fe3O4)、适配体、枝状聚合物 EnVisionTM和金属有机框架物(MOF)、酶等材料用于生物传感器的构建，通过 DNA链杂交、适配体与目标物特异性结合、纳米组装技术和电化学分析技术，制备出了几种多元电化学生物传感器，并对其性能和原理进行了研究和探索。
　　本研究工作从以下几个方面进行：
　　1、基于磁性量子点-编码枝状纳米示踪物构建的电化学信号增强法用于同时测定氯霉素和多氯联苯
　　本章描述了基于适配体的电化学伏安法用于同时测定食品中的污染物——氯霉素(CAP)和多氯联苯-72(PCB72)。首先将CAP和PCB72的巯基化适配体通过自组装修饰到磁性金纳米颗粒(Fe3O4@Au)上作为捕获探针；其次，将 CAP和 PCB72适配体的互补链(cDNA1或cDNA2)和量子点(CdS或PbS)同时修饰到枝状聚合酶(EnVisionTM)以形成两种相应的纳米示踪物。EnVisionTM(EV)是一种含有大量酶和次级抗体组成的树枝状酶链聚合物，可放大电化学信号，提高检测方法的灵敏度；最后，通过适配体和 cDNAs之间的杂交反应得到适配体编码复合磁性探针。当复合磁性探针上的两种适配体分别捕获 CAP和PCB72时，两种相应的纳米示踪物通过双链解旋和磁性分离后出现在上清液中。将纳米示踪物上的编码量子点用酸溶解后，得到的金属离子 Cd2+和 Pb2+可由电化学溶出伏安法检测处可区分的电化学信号，该信号分别对应两种目标物的含量。此方法检测 CAP和PCB72的线性范围在0.001至100 ng mL-1，检测限分别为0.33和0.35 pg mL-1(S/N=3)。该方法可以通过替换相应的适配体应用于其它抗生素及有害物质的检测，因此在食品安全和环境监测等方面具有广阔的前景。
　　2、基于适配体-金属离子-纳米级金属有机框架生物编码探针的新型电化学适配体传感器用于信号放大和多组分抗生素的同时检测
　　本章开发了一种基于适配体-金属离子-纳米级金属有机框架的编码探针(APT-M-NMOF)用于同时检测卡那霉素(KAN)和氯霉素(CAP)。在本部分工作中，我们首先通过偶联反应使氨基化的KAN和CAP适配体同时修饰在氨基化磁微粒上得到捕获探针。然后用具有大比表面积和内含大量-NH2的NMOF(UiO-66-NH2)分别富集两种金属离子（Pb2+和Cd2+），吸附量均可达到260 mg/g。两种M-NMOF进一步分别标记KAN和CAP适配体的互补链形成信号探针，再通过碱基互补配对原则将信号探针与捕获探针组装成生物编码探针（APT-M-NMOF）。该探针中的适配体能够特异性结合目标物（KAN和 CAP）并释放信号探针。经过磁性分离后，上清液中的信号探针不需要酸溶解就可以通过方波伏安法(SWV)检测。在最优条件下测得 KAN和 CAP的检测限分别低至0.16 pM和0.19 pM(S/N=3)，线性范围是0.002到100 nM。该方法具有优异的信号放大效率，足够的选择性和更强的抗干扰性，且成功的用于牛奶中抗生素的检测，检测结果与商业化的酶联免疫分析法得出的结果相一致。此外，通过适当替换相对应的适配体和增加金属离子种类，该生物编码探针APT-M-NMOF可以用于其他抗生素和小分子有害物质的同时检测。
　　3、金属离子掺杂的纳米级金属有机框架作为信号纳米标签及RecJf外切核酸酶辅助目标物循环放大的电化学适配体传感器用于多重抗生素的同时检测
　　为进一步提高 MOF基电化学适配体传感器的灵敏性，本章在上一章工作的基础上，将金属离子掺杂的MOF作为信号纳米标签和RecJf核酸外切酶催化的目标物循环扩增体系引入到电化学适配体传感器的构建，并用于同时检测土霉素(OTC)和卡那霉素(KAN)。该传感器由捕获磁珠和基于纳米级 MOF(NMOF)的信号示踪探针组成。首先，将金属掺杂的NMOF与两种目标物的氨基化适配体进行偶联作为信号纳米标签。然后，将抗单链 DNA抗体标记到磁珠上用于磁性分离。由于抗单链 DNA抗体可通过特殊的氢键作用选择性识别单链DNA，因此该传感器可由抗单链DNA抗体和适配体之间的特异性识别作用自组装形成。在目标物(OTC和KAN)存在时，适配体优先与目标物结合，并且被磁珠释放出来。RecJf外切核酸酶可选择性的将绑定目标物的适配体分解单核苷酸，然后释放的目标物可进一步参与下一循环反应以产生更多的信号示踪物。与无 RecJf外切核酶参与的体系相比，该体系信号增强约10倍。实验结果表明，同时检测OTC和KAN的线性范围在0.5 pM至50 nM，检测限分别为0.18 pM和0.15pM(S/N=3)。该策略为多重抗生素的同时检测提供了一个特异性好和灵敏度高的检测方法，并且有望应用在食品分析领域中。
　　4、基于金属离子编码NMOF的Y-DNA结构探针和目标物触发CSRP信号放大策略的电化学适配体传感器用于多种抗生素的检测
　　该章设计的“Y”结构DNA探针(Y-DNA)由三种探针组成，即：辅助DNA探针，捕获DNA探针和信号DNA探针。其中，将巯基化DNA修饰到磁性纳米金构成辅助DNA探针；捕获DNA探针是一段含有适配体和引物链互补区域的DNA链；信号DNA探针则由封装大量金属离子(Pb2+或Cd2+)的NMOF标记DNA构成。这三种探针可经过DNA杂交自组装形成 Y-DNA结构探针。在目标用氯霉素(CAP)和土霉素(OTC)存在时，捕获 DNA的构象变化使得引物链的互补区域裸露。随后，暴露的捕获 DNA序列可作为引发物，并在Bst DNA聚合酶的辅助下引发目标循环诱导的聚合反应并释放更多的信号 DNA探针。最终实现电化学信号的放大。该放大策略表现出较高的灵敏性，CAP和 OTC的检测范围为0.1pM-50 nM，检测限分别为为33 fM和48 fM(S/N=3)。该方法在食品安全领域中的有害残留物的检测上具有广阔的前景。

目录

引言

1文献综述

1.1生物传感器概述

1.2电化学适配体生物传感器

1.3基于多目标物同时检测的电化学生物传感器研究进展

1.4电化学生物传感器的信号放大策略及应用

1.5本论文的基本思路及其创新点

2基于磁性适配体—量子点编码枝状纳米示踪物用于信号放大的电化学方法同时检测氯霉素和多氯联苯

2.1引言

2.2实验部分

2.3结果与讨论

2.4本章小结

3基于适配体-金属离子-纳米级金属有机框架生物编码探针的新型电化学适配体传感器用于信号放大和多组分抗生素的同时检测

3.1引言

3.2实验部分

3.3结果与讨论

3.4本章小结

4金属离子掺杂的纳米级金属有机框架作为信号纳米标签及RecJf外切核酸酶辅助目标物循环放大的电化学适配体传感器用于多重抗生素的同时检测

4.1引言

4.2实验部分

4.3结果与讨论

4.4本章小结

5基于金属离子编码NMOF的Y-DNA结构探针和目标物触发CSRP信号放大策略的电化学适配体传感器用于多种抗生素的检测

5.1引言

5.2实验部分

5.3结果与讨论

5.4本章小结

6全文总结

参考文献

7在学研究成果

致谢