脐血内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠下肢缺血的研究

摘要

目的:糖尿病并发症是威胁人类健康的世界性公共卫生问题。糖尿病血管并发症发病率高,其中周围血管病变所致下肢缺血可致足溃疡,甚至截肢,是糖尿病致残的重要因素,给病人及家属带来极大的痛苦及负担。糖尿病下肢缺血发病机制复杂,目前认为主要因为是动脉粥样硬化同时伴侧支循环受损,其中侧支血管能力形成受损占重要地位。近年来的大量研究表明内皮祖细胞(EPC)在血管形成中起重要作用。正常情况下循环EPC的相对数量较少,而在创伤或缺血时显著增加。但糖尿病患者EPC增殖能力远低于非糖尿病患者,且与活化内皮细胞的粘附、增殖以及形成小血管的能力下降,缺血组织对外源性生长因子反应性也降低。脐血中存在内皮祖细胞,其数目高于同等量外周血,取材无创伤,易找到HLA相合的供者,可长期保存。使用脐血内皮祖细胞治疗糖尿病血管病变是一个值得研究的领域,但目前国内外尚缺乏此方面的实验研究。故本研究采用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,结扎大鼠双后肢股动脉形成下肢缺血,应用射线照射减轻大鼠排斥反应,抽取足月产妇脐血,分离脐血单核细胞,培养细胞7天,获得内皮祖细胞,经尾静脉注射或者局部肌肉注射,将内皮祖细胞移植入大鼠。荧光示踪内皮祖细胞,观察大鼠双后肢溃疡变化情况,通过对腓肠肌中Ⅷ因子与VEGF表达的研究,探讨脐血内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的效果及方法。方法:1、脐血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定:取产妇足月产脐血50 ml,运用密度梯度离心法分离获得单核细胞,利用内皮祖细胞贴壁的生长特性,培养细胞7天,贴壁生长细胞即含内皮祖细胞。将培养细胞消化,‘用细胞表达因子(CD133,CD34,KDR)经流式细胞仪鉴定内皮祖细胞,并计数活细胞数,达到移植有效活细胞数。2、糖尿病大鼠模型的建立及分组:将20只体重约200～250 g的健康雄性Wistar大鼠常规喂养一周后,随机选取15只给予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)55 mg/kg复制糖尿病模型,5只正常大鼠给予柠檬酸缓冲液等容量注射作为正常对照组。上述大鼠分为四组:①糖尿病股动脉结扎后经尾静脉注射EPC治疗组(Diabetes+ligation+intravenous injection,DLV):上述糖尿病大鼠射线照射后结扎双后肢股动脉,复制缺血模型,再经尾静脉注射EPC,观察经尾静脉注射EPC治疗后下肢缺血的疗效。②糖尿病股动脉结扎后局部肌肉注射EPC治疗组(Diabetes+ligation+intramuscular injection,DLM):糖尿病大鼠射线照射后结扎双后肢股动脉,右后肢局部注射EPC,观察缺血局部肌肉注射EPC治疗后下肢缺血的疗效。左后肢局部注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)作为糖尿病股动脉结扎治疗的对照组(Diabetes+ligation+control,DLC)。③糖尿病未处理组:糖尿病不结扎不注射EPC(Diabetes control withoutEPC injection and ligation,DC)。④正常大鼠股动脉结扎后经尾静脉EPC移植治疗组(Normal+ligation+intravenous injection,NLV):正常血糖大鼠射线照射后结扎双后肢股动脉,尾静脉注射EPC。3、各组大鼠进行如下实验:①荧光示踪内皮祖细胞:用GFP(绿色荧光)在内皮祖细胞注射前转染内皮祖细胞,转染成功后移植入大鼠,一周后取腓肠肌组织作冰冻切片,观察有无荧光表达并对比荧光强度,示踪内皮祖细胞是否到达缺血部位。②腓肠肌HE染色与Ⅷ因子免疫组化染色观察毛细血管数:注射内皮祖细胞后21天,处死大鼠,无菌操作取腓肠肌,固定,脱水,石蜡包埋,行HE染色和Ⅷ因子的免疫组化染色,通过观察肌纤维间毛细血管数情况了解内皮祖细胞治疗后侧支循环有无改善,内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的疗效。③RT-PCR检测双后肢腓肠肌VEGF mRNA表达:注射内皮祖细胞后21天,处死大鼠,无菌操作取腓肠肌,行RT-PCR检测VEGF mRNA表达,从基因水平研究内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的疗效。4、统计学处理:应用SPSS13.0统计软件分析数据,计量资料以均数±标准差((x)±s)表示,DLC组与DLM组、DLV组、NLV组、DC组间应用单因素方差分析及SNK-q检验,DLV组与DLM组间使用配对设计均数比较t检验,P<0.05表示统计学有意义。结果:1、分离的脐血内皮祖细胞的鉴定:流式细胞仪测定培养7天细胞CD34含量最高,CD133次之,KDR含量最少,提示为早期内皮祖细胞。2、大鼠一般情况及大鼠双后肢缺血变化情况:与正常大鼠比较,糖尿病组在注射STZ两天后开始出现明显多饮、多尿、毛发干枯。结扎股动脉后到21天处死期间,注射内皮祖细胞的后肢,其缺血及溃疡愈合较未注射内皮祖细胞后肢改善明显,愈合速度加快。尾静脉注射肢与局部注射肢改善差别不明显。糖尿病大鼠与正常大鼠溃疡恢复无明显差别。3、内皮祖细胞的荧光示踪情况:注射内皮祖细胞腓肠肌中有荧光表达,荧光亮度强,尾静脉注射与局部注射荧光亮度相似；DLC组腓肠肌中有荧光表达,但很少；DC组腓肠肌无荧光表达。4、腓肠肌HE染色与Ⅷ因子免疫组化染色情况:各组每低倍镜视野毛细血管数均值:DLC(4.75±0.957),DLM(18.5±8.737),DLV(18.75±4.349),NLV(21±2.944),DC(17±3.162)。注射内皮祖细胞与DC组腓肠肌中毛细血管数多于DLC组腓肠肌中毛细血管数,分布密集,其差异有统计学意义(P<0.05)；尾静脉注射与局部注射相比毛细血管数无明显差别(P>0.05)。5、VEGF mRNA的表达情况:各组VEGF mRNA2-△△CT均值:DLC(1.029±0.293),DLM(2.707±0.946),DLV(2.621±0.414),NLV(3.121±1.734),DC(3.414±0.677)。糖尿病注射EPC(DLM、DLV组)、正常尾静脉注射EPC(NLV组)以及糖尿病未结扎股动脉未注射EPC(DC组)大鼠腓肠肌VEGF表达较糖尿病结扎股动脉未注射EPC(DLC组)腓肠肌增高,其差异有统计学意义(P<0.05),尾静脉注射与局部注射肢腓肠肌VEGF表达无明显差异(P>0.05)。糖尿病大鼠尾静脉注射与正常大鼠尾静脉注射无明显区别(P>0.05)。结论:1、脐血内皮祖细胞是治疗糖尿病大鼠下肢缺血的有效方法。2、脐血内皮祖细胞尾静脉注射与肌肉局部注射对下肢缺血的疗效无明显差别。

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糖尿病足内皮祖细胞治疗现状(综述)

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