银鲳丝氨酸蛋白酶(SP)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的表达与摄食水母的关系

摘要

银鲳（Pampus argenteus）是中国近年来正在开发养殖的具有重要经济价值的海洋鱼类，其生长较快，养殖鱼体脂肪含量较少，且具有骨软刺少肉质细嫩等特点。有关银鲳喜食水母的事实已被许多学者经实验证实，在银鲳养殖实践中也发现这一有趣的现象。经观察发现银鲳摄食水母后，不但不会中毒，反而能促进生长，这是一个很值得深究的问题。因此，探索银鲳摄食水母后体内的调控与解毒机制就成为一个重要课题，为了弄清银鲳摄食水母后体内相关酶活力及其基因及蛋白的表达，本研究以投喂水母的银鲳为研究对象，首先分析比较了投喂水母与否对银鲳丝氨酸蛋白酶(serine proteinase，SP)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)两种酶活力变化规律的影响；从银鲳转录组数据同源比对获得核心片段经验证后运用RACE方法获得了银鲳SP基因和MMP-9基因序列的全长；并利用荧光定量RT-PCR技术分析了SP mRNA和MMP-9mRNA在银鲳6个组织间和不同投喂方式下的表达水平；且进一步用蛋白质印迹(Western Blot)技术检测了SP和MMP-9酶蛋白在银鲳不同组织和不同投喂天数下的表达水平。本研究旨在从SP和MMP-9两种酶活力变化规律，SP和MMP-9基因的时空表达水平，以及SP和MMP-9两种酶蛋白的表达量差异，阐明这三个层面之间的联系与调节机制。以期对银鲳摄食水母的解毒机理进行初步探索，为今后银鲳养殖实践中适量添加水母提供理论依据。现将本论文的主要结论概述如下： （1）从SP和MMP-9酶活力测定结果得到：三种投喂条件下，在肝、胃、侧囊、盲囊、肠道、肾脏6种组织中SP和MMP-9酶活力均以肾脏中最高(P＜0.05)；在组间两酶活力皆为投喂水母A组＞混合投喂C组＞投喂饲料B组(P＜0.05)；投喂天数上两酶活力均以A组完全投喂水母20d时最高(P＜0.05)，为188.91UL/L和161.95UL/L，分别是0d时的3.65倍和1.55倍。 （2）反转投喂后SP和MMP-9酶活力表现为A'组＜A组及B'组＞B组，改投饲料的A'组两酶活力出现骤跌，与0d无显著差异（P＞0.05），而改投水母的B'组则上升至183.44UL/L。研究表明SP及MMP-9酶在银鲳消化分解水母的过程中确实起着重要的调节作用，前者比后者对水母更为敏感，且肾脏可能是最重要的水母毒素解毒和调节器官。 （3）首次克隆得到了银鲳SP cDNA全长序列(Genbank登录号：MH021960)和MMP-9cDNA全长序列(Genbank登录号：MH021959)。SP基因序列全长为1006bp，含有791bp的开放阅读框(ORF)编码262个氨基酸，等电点(pI)为5.05，分子质量经计算约为30.00kDa，前16个氨基酸构成SP的信号肽，由氨基酸序列的同源性分析得出，银鲳与黑椎鲷（Acanthopagrus schlegeli）的同源性最高为98%，与其它鲈形目同源性为78%以上，银鲳在进化上与斑马拟丽鱼（Maylandia zebra）亲缘关系最近，与鲤形目（Cyprinomorpha），鲑形目（Salmoniformes）的进化距离较远。MMP-9基因序列全长为2783bp，其ORF编码632个氨基酸。MMP-9的理论等电点(pI)为4.82，分子质量约为92.00kDa。MMP-9氨基酸同源性分析发现高体鰤（Seriola dumerili）与银鲳同源性为83%达到最高；与其它鲈形目鱼类为79%-82%的同源性；进化树分析得出，银鲳进化上与高体鰤关系最近，其次与鳜鱼（Siniperca chuatsi）、贝氏隆头鱼（Labrus bergylta）、公子小丑鱼（Amphiprion ocellaris）、多刺棘光鳃鲷（Acanthochromis polyacanthus）、黄鳝（Monopterus albus）等关系较近，依次与鲤形目（Cyprinomorpha）、有尾目（Ametoptera）、鸡形目（Galliformes）、龟鳖目（Tesudines）、雀形目（Passeriformes）、鹦形目（Lepigidae）、鸻形目（Phrynomorpha）等在进化上距离相对较远。 （4）用QPCR和RT-PCR技术检测结果显示，SP mRNA在银鲳肝脏、胃、侧囊、盲囊、肠、肾脏6种组织中均有分布，但存在组织间表达特异性，投喂水母的A组肾组织中高表达(P＜0.05)；组间SP mRNA表达量总体呈现A组＞C组＞B组的趋势；A组随投喂水母天数增加SP mRNA表达量迅速上调，在20d时达到峰值，是0d对照的7.99倍，而此时投喂饲料的B组表达量仅为A组的1/2。混合投喂的C组表达量变化介于A、B组之间。A'组反转投喂饲料后SP mRNA表达量显著下调1/2以上，而B'组反转投喂水母后表达量急剧上调3.1倍。 （5）用Western Blot技术得到佐证，摄食水母与否及摄食时间的长短都会影响体内SP蛋白的表达。SP蛋白大致也呈现A组＞C组＞B组，A'组＜A组及B'组＞B组的变化规律(P＜0.05)；在肾组织中SP蛋白高表达，且以A组20d时肾组织中表达量最高，而15d的A'组表达最低。 （6）同样用QPCR和RT-PCR技术检测结果显示，MMP-9mRNA在银鲳肝脏、胃、侧囊、盲囊、肠、肾6种组织中也均有特异性分布，也在A组肾组织中最表达(P＜0.05)，组间MMP-9mRNA表达量呈现A组＞C组＞B组的趋势(P＜0.05)；A组随天数增加MMP-9mRNA表达量迅速上调，20d时达峰值，是0d的2.17倍，是B组和C组20d时的1.74倍和1.13倍(P＜0.05)；A'组表达量急剧下调，15d时最低表达，B'组投喂水母后表达量迅速上调，达0d的2倍。Western Blot验证结果也显示，MMP-9蛋白在肾脏中高表达，且在15d的A'组表达最低；整体呈现A组＞C组＞B组，A组＞A'组及B'组＞B组的变化趋势。 （7）本研究从SP及MMP-9酶活力、mRNA与蛋白的表达结果清晰地发现，银鲳摄食水母后因水母毒素作用，会引起SP及MMP-9基因的mRNA表达上调，从而引起SP蛋白的表达量上调，导致了SP及MMP-9酶活力的升高，最终起到对水母毒素的调节和解毒作用。而且这种解毒作用随着银鲳摄食水母的时间延长呈增强趋势，SP对水母的响应比MMP-9更为敏感。

目录

声明

引言

1 绪论

1.1 银鲳的研究现状

1.2 水母毒素的研究现状

1.3 SP和MMP-9基因的研究概况

1.3.1 MMP-9基因的研究进展

1.3.2 SP基因的研究进展

1.4 SP与MMP-9在机体调节中的相互作用

1.5Real-timePCR与Western Blot技术

1.6 本文的研究目的和意义

2 银鲳摄食水母后SP及MMP-9酶活力变化研究

2.1实验材料和方法

2.1.1 实验材料来源

2.1.2 试验设计

2.1.3 主要试剂与仪器

2.1.4 分析测定方法

2.1.5 数据分析

2.2实验结果

2.2.1三种投喂条件下银鲳SP酶活力的变化

2.2.2三种投喂条件下银鲳MMP-9酶活力的变化

2.3讨论

2.4本章小结

3 银鲳SP基因全长cDNA的克隆与序列分析

3.1实验材料和主要仪器

3.1.1 实验银鲳来源

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 引物序列

3.2 实验方法

3.2.1 引物设计

3.2.2 银鲳肝脏总 RNA的提取

3.2.3 cDNA第一链的合成

3.2.4 银鲳SP基因目的片段的克隆及测序

3.2.5 RACE扩增银鲳 SP基因序列全长

3.2.6 SP生物信息学分析

3.3 实验结果

3.3.1 银鲳SP全长cDNA的克隆

3.3.2 银鲳SP序列特征分析

3.3.3 银鲳SP蛋白结构分析

3.3.4 银鲳SP氨基酸序列同源性分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

4 银鲳摄食水母后 SP基因及酶蛋白的表达

4.1 实验材料与主要仪器

4.1.1 实验材料来源

4.1.2 试验设计

4.1.3 取样

4.1.4 主要试剂

4.1.5 主要仪器

4.1.6 引物序列

4.1.7 实验主要溶液配制方法

4.2 实验方法

4.2.1 SP基因半定量及实时荧光定量

4.2.2银鲳SP蛋白Western Blot

4.3 实验结果

4.3.1银鲳不同组织中SP mRNA及其蛋白的表达

4.3.2银鲳肾脏组织中SP mRNA及其蛋白的表达

4.4 讨论

4.5 本章小结

5 银鲳MMP-9基因全长cDNA的克隆与序列分析

5.1 实验材料和主要仪器

（1）实验银鲳来源

（2）主要试剂

（3）主要仪器

（4）引物序列

5.2 实验方法

5.2.1 引物设计

5.2.2 银鲳肝脏组织总 RNA的提取

5.2.3 cDNA的第一链合成

5.2.4 银鲳MMP-9基因目的片段的克隆

5.2.5 RACE扩增银鲳MMP-9基因序列全长

5.2.6 生物信息学分析

5.3 实验结果

5.3.1 银鲳MMP-9全长 cDNA的克隆

5.3.2 银鲳MMP-9基因序列特征分析

5.3.3 银鲳MMP-9蛋白结构分析

5.3.4 银鲳MMP-9氨基酸序列同源性分析

5.4 讨论

5.5 本章小结

6银鲳摄食水母后 MMP-9基因及酶蛋白的表达

6.1 实验材料与主要仪器

（6）引物序列

（7）实验主要溶液配制方法

6.2 实验方法

6.2.1 MMP-9基因半定量及荧光定量

6.2.2银鲳MMP-9蛋白Western Blot

6.3 实验结果

6.3.1银鲳不同组织中MMP-9 mRNA及其蛋白的表达

6.3.2银鲳肾脏组织中MMP-9 mRNA及其蛋白的表达

6.4 讨论

6.5 本章小结

7 结论与创新点

7.1结论

7.2创新点

参考文献

在学研究成果

致 谢