海洋致病菌现场检测技术的研究

摘要

本论文对海洋致病菌、金标银染技术、二维类石墨烯材料、电化学发光和阳极溶出法做出了系统性阐述。二维结构的纳米材料，如：氧化石墨烯、氮化碳等，具有比表面积大、化学性质单一且表面富含官能团等优点。它们被广泛运用于生物医学和分析检测领域。本论文将二维纳米材料与高灵敏的金标银染技术、阳极溶出法相结合，开发了一系列简单、价廉的免疫传感器。为进一步发展新型海洋致病菌现场检测方法奠定了坚实的基础。具体内容如下： 1、基于“圣诞树式”GLSS的VP可视化检测 本章基于多功能化的g-C3N4材料，制备了一种“圣诞树式”放大模式的免疫传感器。该方法实施过程如下：捕获抗体被固定在固相支持物上，随后，加入待检样品，然后加入带有AuNPs@g-C3N4的检测抗体。最后通过银染沉积的方式，测定银染信号的强弱。银染信号可通过Matlab程序换算成相应的灰度值。G-C3N4具有较大的比表面积，其表面可携带大量的AuNPs，从而增加检测抗体上信号物的数量，这为设计该免疫传感器提供了基础。最佳条件下，本传感器最低检测限低于102cfu/mL，灵敏度是传统GLSS的100倍左右。该传感器具有简单、价廉、结果可凭肉眼识别等优点。更要的是，本方法无需大型仪器和配备专门的检测人员。所以，基于“圣诞树式”GLSS的VP可视化检测方法为高灵敏现场检测海洋致病菌提供了新思路。 2、法拉第笼式电化学免疫传感器检测副溶血性弧菌 基于“法拉第笼式”免疫模式并结合阳极溶出伏安技术，本章开发了一种高灵敏检测VP的电化学免疫传感器。AgNPs@GO作为标记物被标记在二抗上作为检测单元。捕获抗体、VP与检测单元的免疫反应在磁性玻碳电极上进行。该传感器灵敏度较高，原因如下：（1）GO具有较大的比表面积，可承载大量的AgNPs，所以检测单元的标记物增多，信号自然加强；（2）本章采用了“法拉第笼式”免疫模式，如此，检测单元中负载在GO上的AgNPs都可发射信号。最优条件下，该传感器的响应电流与VP浓度的对数在102-108cfu/mL之间线性良好，检测限为33cfu/mL。同时该传感器在海水和海鲜食品中也有良好的表现，所以该免疫传感器可以对食品中的VP进行实时监测。 3、基于FSSV和ECL技术的双通道免疫传感器检测创伤弧菌 基于多功能化g-C3N4，本章开发了一种检测创伤弧菌的双通道免疫传感器。本章合成了AgNPs@g-C3N4复合物，并在检测抗体上标记AgNPs@g-C3N4作为检测单元。AgNPs@g-C3N4不仅可作为FSSV的溶出信号物，而且可发射ECL信号。高能电子会使g-C3N4发生钝化，AgNPs可俘获和储存高能电子，所以AgNPs@g-C3N4与g-C3N4相比，表现出强且稳定的ECL活性。本研究采用FSSV作为溶出方法，与普通ASV相比，FSSV的高扫描速率可放大信号，从而提高灵敏度。最优条件下，该免疫传感器对VV的检测范围为10-105cfu/mL，LOD=3cfu/mL。同时，该免疫传感器也获得了良好的稳定性，重现性和精确性。

目录

声明

主要符号表

引言

1文献综述

1.1海洋致病菌

1.1.1海洋致病菌的概念

1.1.2副溶血性弧菌

1.1.3创伤弧菌

1.1.4海洋致病菌的检测方法

1.1.5最大可能计数法（MPN）

1.1.6 聚合酶链式反应（PCR）

1.1.7环介导等温扩增技术（LAMP）

1.1.8酶联免疫吸附法（ELISA）

1.2二维石墨烯材料

1.2.1石墨相氮化碳的概述及其检测应用

1.2.2氧化石墨烯的概述及其检测应用

1.3金标银染技术

1.3.1金标银染技术的基本概念及原理

1.3.2金标银染技术在检测领域的应用

1.4电化学发光

1.4.1电化学发光概念

1.4.2电化学发光基本原理

1.4.3三联吡啶钌发光原理

1.4.4鲁米诺发光原理

1.4.5 ECL在致病菌检测中的应用

1.5阳极溶出伏安法与快速扫描溶出伏安法

1.5.1阳极溶出伏安法原理及应用

1.5.2快速扫描溶出伏安法原理及应用

2基于“圣诞树式”GLSS的VP可视化检测

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1主要仪器与试剂

2.2.2主要溶液的配制

2.2.3 g-C3N4的合成

2.2.4纳米金的合成

2.2.5 dAb-AuNPs@g-C3N4的合成

2.2.6固相支持物的硅烷化

2.2.7“圣诞树式”免疫反应

2.3结果与讨论

2.3.1实验原理

2.3.2传感器的可行性

2.3.3实验条件的优化

2.3.4线性及灵敏度

2.3.5传感器特异性研究

2.3.6传感器的稳定性、重现性研究

2.3.7免疫传感器的实际应用

2.4本章小结

3法拉第笼式电化学免疫传感器检测副溶血性弧菌

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1试剂、材料及仪器

3.2.2主要溶液的配制

3.2.3纳米银的制备

3.2.4氨基化Fe3O4的合成

3.2.5 AgNPs@GO的合成

3.2.6捕获单元（cAb@Fe3O4）和检测单元（AgNPs@GO-dAb）的制备

3.2.7电化学免疫传感器的制备

3.2.8电化学测试

3.3结果与讨论

3.3.1电化学传感器的原理

3.3.2材料表征

3.3.3法拉第笼式免疫传感器的构建及表征

3.3.4测定条件的优化

3.3.5 VP检测

3.3.6选择性

3.3.7稳定性与重现性

3.3.8实际样品分析

3.4本章小结

4基于FSSV和ECL技术的双通道免疫传感器检测创伤弧菌

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1试剂及材料

4.2.2仪器

4.2.3主要溶液的配制

4.2.4 VV菌株培养及实验样品的制备

4.2.5 AgNPs及g-C3N4的合成

4.2.6氨基化Fe3O4与AgNPs@g-C3N4的合成

4.2.7捕获单元（cAb@Fe3O4）和检测单元（AgNPs@g-C3N4-dAb）的制备

4.2.8双通道免疫传感器的制备

4.2.9电化学和电化学发光测试

4.3结果与讨论

4.3.1双通道免疫传感器的原理

4.3.2材料表征

4.3.3双通道免疫传感器的构建、表征

4.3.4传感器的可行性

4.3.5测定条件的优化

4.3.6 VV检测

4.3.7选择性

4.3.8稳定性与重现性

4.3.9实际样品分析

4.4本章小结

5结论和展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

在学研究成果

致谢