联合应用Rho-ROCKII及GSK-3β抑制剂促进新生大鼠DRGNs轴突再生的体外实验研究

摘要

目的： （1）观察完全性截瘫大鼠脊髓提取液对新生大鼠背根节神经元（DRGNs）轴突生长的影响； （2）观察联合应用Rho—ROCKⅡ和GSK—3β抑制剂对大鼠背根节神经轴突再生和延长的影响。 方法： （1）健康雌性SD成年大鼠15只，随机分为：手术瘫痪组（5只）、假手术对照组（5只）和正常组（5只）。WD法制成SD大鼠T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型，造模7d后取T8—10节段脊髓制作脊髓提取液。 （2）新生大鼠DRGNs体外培养：取新生SD大鼠（<5d），显微操作下取胸腰段背根节（20～25个/只），酶解消化、机械吹打、离心、重悬、纯化，进行元代培养观察与鉴定。 （3）实验一分组：A组，DRGNs+PBS；B组，DRGNs+正常脊髓提取液：C组，DRGNs+假手术脊髓提取液；D组，DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液。 （4）实验二分组：A组，DRGNs+PBS；B组，DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液；C组，DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液+Y26732；D组，DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液+TDZD—8；E组，DRGNs+完全性截瘫大鼠脊髓提取液+Y26732+TDZD—8。 （5）观察指标：共同培养1、2d后相差显微镜下照相、固定后免疫荧光，观察神经轴突长度、TubulinβⅢ阳性表达以及轴突远端平均荧光密度，实验结果采用SPSS13.0统计软件做单因素方差分析。 结果： （1）实验一各组共同培养1d平均神经轴突长度：A组为144±28um，B组为134±11um，C组为125±30um，D组为47±5um；共同培养2d后：A组为211±21um，B组为182±15um，组为156±13um，D组80±8um。共同培养1、2d后，D组和A、B、C组之间分别比较差别有显著性；C组和A、B组之间分别比较差别有统计学意义；A和B组之间比较差别无统计学意义。共同培养2d后，轴突远端平均荧光密度分别是：A组为200.4±4.0AFU/um，B组为199.2±6.6 AFU/um，C组为194.6±7.0AFU/um；D组为75.1±4.1AFU/um。在A组和B组中，神经轴突干和生长锥的TubulinβⅢ阳性表达强，而C组中TubulinβⅢ阳性表达弱，D组比C组TubulinβⅢ阳性表达更弱，特别在轴突远端和生长锥。D组和A、B、C组之间分别比较差别有显著性； A、B、C组之间比较差别无统计学意义。 （2）实验二各组共同培养2d后平均神经轴突长度：A组为402±33um，B组为125±18um，C组为404±14um，D组为398±41um，E组为405±12um。B与其他组之间两两比较均有显著统计学意义；C、D、E组之间比较无统计学意义。共同培养2d后，轴突远端平均荧光密度分别是：A组为208.2±5.6 AFU/Um，B组为67.1±4.2 AFU/um，C组为362.6±5.6 AFU/um，D组为365.6±39.3AFU/um，E组为379.8±23.6 AFU/um。在A、C、D和E组中，神经轴突干和生长锥的TubulinβⅢ阳性表达强，而B组中TubulinβⅢ阳性表达弱，特别在轴突远端和生长锥。B组和其他组差别均有显著统计学意义，E组和A、C、D组差别有统计学意义。 结论： （1）完全瘫痪脊髓提取液能明显抑制DRGNs轴突生长，导致生长锥塌陷；假手术脊髓提取也能轻度抑制轴突生长，但生长锥无明显塌陷；正常脊髓不影响轴突生长。 （2）30uMY27632能明显促进轴突生长，形成细长的生长锥。 （3）1uM TDZD—8能促进轴突生长，形成多个轴突或轴突分支，粗大生长锥。 （4）适当浓度的TDZD—8和Y27632联合应用可明显导致轴突延长，形成多个轴突或明显轴突分支，比单一应用抑制剂作用更明显。

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