电穿孔介导的基因治疗兔下颌骨牵引成骨模型建立与鉴定

摘要

牵引成骨自1905年由Codivilla首先用于矫形外科，后由Ilizarov系统发展、推广治疗长骨短小畸形，1992年由McCarthy应用于颅颌面外科临床。目前已应用于颅面部各部位，但牵引成骨的某些局限性如牵引速度受限、治疗周期长、牵引过快过长导致新骨形成不良等问题限制了其在临床上的进一步推广应用。因此，寻找一种加速新骨形成、缩短牵引成骨治疗周期的方法必将使病人受益。本研究着眼于利用电穿孔技术将重组质粒转染下颌骨牵引区，试图利用基因治疗的方法促进下颌骨牵引成骨，进行了一系列的探索。首先建立兔双侧下颌骨牵引成骨的动物模型，然后在此模型基础上进行了电穿孔技术（electroporation）介导的基因体内转染，目的基因的表达检测。简述如下： 第一部分：兔双侧下颌骨牵引成骨模型的建立 目的：建立具有良好可行性及可重复性的兔双侧下颌牵引成骨模型，为下颌骨牵引成骨的深入研究奠定基础。方法：选用20只成年新西兰大白兔，随机分为5组，每组4只，在下颌体近下颌角处全层截断下颌骨，用兔下颌骨专用牵引器固定，经过3天潜伏期，以0．8mm/d速度牵引，连续10天。分别在潜伏期末、牵引结束、固定期第2周、第4周、第8周行X线、3dCT检查后处死动物，切取标本行组织学观察。结果：实验动物全部耐受实验，除一例伤口感染外无其他并发症。牵引装置足够稳定，产生并维持了所需的牵引距离。全部动物的下颌骨被成功延长，牵引间隙逐渐被新生骨组织充填。结论：以兔下颌骨建立牵引成骨模型经济，有良好的可行性和可重复性。 第二部分：电穿孔介导的基因治疗兔下颌骨牵引成骨模型建立与鉴定 目的：探讨电穿孔介导的重组质粒体内转染兔下颌骨牵引成骨的可行性并给予鉴定。方法：取新西兰大白兔30只，沿双侧下颌骨边缘切开皮肤，钝性分离附着下颌骨的肌肉，暴露下颌骨。于下颌骨颏孔处，用微型电动钻截开下颌骨，于下颌骨断开处安放2cm牵引器，固定，逐层缝合组织。于术后3天开始牵引，每天0．8mm，连续牵引10天后，将兔随机分为3组：A组：质粒+电脉冲组，B组：质粒组，C组：生理盐水组。A、C组均施加电脉冲刺激。B组只注射重组质粒而不施加电刺激。各组分别于注射后3小时、1天、3天、7天、14天处死动物，切取牵引区组织约0．4cm×0．4cm大小，立即行冰冻切片检查，用荧光显微镜观察GFP蛋白表达情况，从而检测外源基因的表达。检测兔血清肝功能指标丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）和肾功能指标尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）和心、肝、肾组织学检查。结果：A组转染新西兰大白兔，3小时可观察到绿色荧光蛋白的表达，1天时增强，3天时表达最强，其后开始逐渐下降，7天后表达减少，14天仍可观察到微弱荧光。B组的表达时限与A组相同，但各时相点的表达强度明显弱于A组，C组在各时间段均未观察到绿色荧光蛋白的表达。3组肝肾功能指标两两比较差异无统计学意义（P>0．05）。结论：电穿孔介导的带有荧光标记重组质粒体内转染能够在兔下颌骨牵引区组织内表达，并且电穿孔能明显提高重组质粒的体内转染效率，说明电穿孔介导的重组质粒体内转染兔下颌骨牵引成骨的动物模型是可行的，用于体内实验是安全的。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述：基因治疗与下颌骨牵引成骨

1基因治疗(gene therapy)的定义

2目的基因的选择

2.1骨形态发生蛋白(bonernorphogenetic proteins,BMPs)

2.2转化生长因子-β1(transforming growth factor-betal，TGF—β1)

2.3血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)

2.4.胰岛素样生长因子-1(insulin-like growthfactor-1，IGF-1)

3基因治疗载体系统

3.1病毒载体系统

3.2非病毒载体系统

4基因转染方式

5基因转染受体细胞

6问题与展望

参考文献

第一部分 兔双侧下颌骨牵引成骨模型的建立

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

附图

第二部分 电穿孔介导的基因治疗兔下颌骨牵引成骨模型建立与鉴定

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

附图

全文总结

致谢