发根农杆菌K599侵染黄瓜形成转基因毛状根的初步研究及orf14基因的克隆

摘要

发根农杆菌（Agrobacteriumthizogenes）侵染植物外植体能诱导产生转基因毛状根(hairyroot)。获得的毛状根起源于单细胞而无嵌合体,并能在无植物激素的培养基上自主性快速生长。毛状根可直接作为植物根部线虫等病虫害的宿主;还可应用于环境修复;也可以作为生物反应器,用于生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分。毛状根是发根农杆菌Ri质粒中的T-DNA插入、整合到植物细胞基因组中表达的结果。转基因植物中外源基因的稳定遗传和高效表达是毛状根具有利用价值的前提条件。
　　 本研究利用发根农杆菌K599侵染黄瓜不同外植体获得毛状根,对T-DNA在毛状根中整合的完整性进行了分析;并对长期培养的毛状根中外源基因的稳定性及其表达进行了分析;此外,从发根农杆菌K599中克隆了其T-DNA上的orf14基因,构建了pRI101-AN-orf14-gfp植物表达载体,orf14基因与gfp形成融合蛋白,便于orf14基因功能的分析。主要研究结果如下：
　　 1.利用发根农杆菌K599(属于黄瓜碱型,带内生质粒pRi2659和外源质粒pRI101-AN-gfp)侵染黄瓜不同外植体,其中活体下胚轴和上胚轴的生根效率最高,诱导率均达到了100％。同时获得了较细、分枝多、生长快（Ⅰ型）,粗壮、分枝少、生长较慢（Ⅱ型）两种不同形态的毛状根。本研究建立了一种快捷、高效的毛状根诱导方法,而且为毛状根发生的分子机理的研究以及T-DNA整合规律与毛状根形态相关性的研究提供了材料。
　　 2.对30个独立培养的毛状根根系,进行了PCR检测,分析了T-DNA在毛状根中整合的完整性。内生质粒pRi2659T-DNA上的11个基因orf2、orf3、orf4、orf8、roιA、roιB、roιC、roιD、roιE、orf14、cus以及外源质粒pRI101-AN-gfpT-DNA上的外源基因gfp都插入整合到了植物基因组中。初步分析了发根农杆菌K599介导的转基因过程中T-DNA插入的完整性。
　　 3.对固体培养基上培养3y的黄瓜转gfp基因毛状根进行分析,由组成型启动子35S驱动的gfp基因在转录水平上能正常表达,而且能够翻译出编码蛋白;此外,培养3y后的毛状根,能扩增出与毛状根形态构成有关的roι系列基因。本研究结果表明长期培养的毛状根能保持其遗传稳定性,这为利用毛状根长期工厂化生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分提供了理论依据。
　　 4.从发根农杆菌K599成功克隆了其T-DNA上的orf14基因,并构建了pRI101-AN-orfl4-gfp植物表达载体,其中ORF14能与GFP形成融合蛋白,这为进一步分析orf14基因及功能提供了基础。

目录

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致谢

摘要

目次

第一章 文献综述

1.发根农杆菌与毛状根

1.1 发根农杆菌的生物学特性与分类

1.2 Ri质粒的结构、功能及毛状根诱导的分子机理

1.3 发根农杆菌的转基因策略

1.4 发根农杆菌的转基因方法

1.5 转基因毛状根的培养与繁殖

1.6 转基因毛状根及再生植株的鉴定

1.7 发根农杆菌介导转基因毛状根诱导的影响因素

1.8 毛状根的应用

2 本论文课题的提出

第二章 发根农杆菌K599侵染黄瓜不同外植体产生毛状根的研究

1 材料与试剂

2.实验方法

2.1 发根农杆菌K599侵染离体子叶、上胚轴、下胚轴诱导生根

2.2 发根农杆菌K599侵染活体子叶、上胚轴、下胚轴诱导生根

2.3 转基因毛状根的荧光观察

2.4 转基因毛状根的分子检测

3 结果与分析

3.1 发根农杆菌K599侵染黄瓜不同外植体及毛状根的产生

3.2 转基因毛状根的荧光观察与分子鉴定

4 讨论

第三章 黄瓜转基因毛状根中T-DNA插入整合完整性的初步分析

1 材料与试剂

2 实验方法

2.1 引物设计

2.2 转基因毛状根基因组DNA提取

2.3 转基因毛状根的分子检测

3 实验结果

3.1 除菌分析

3.2 T-DNA整合完整性分析

4 讨论

第四章 长期培养的黄瓜毛状根中外源基因遗传稳定性的分析

1 材料与试剂

2 实验方法

2.1 毛状根的继代培养

2.2 gfp基因和rol(root loci)位点系列基因的PCR扩增

2.3 gfp基因的荧光定量PCR分析

2.4 Western blot杂交以及荧光观察

3 实验结果

3.1 长期培养的毛状根中诉基因和rol系列基因PCR扩增结果

3.2 长期培养的毛状根中gfp基因的表达结果

4 讨论

第五章 发根农杆菌K599 orf14基因的克隆

1 材料与试剂

2 实验方法

2.1 orf14基因的克隆

2.2 植物转基因表达载体PRI101-AN-orf14-gfp的构建

3 实验结果

3.1 orf14基因的克隆和测序分析

3.2 植物转基因表达载体pRI101-AN-orf14-gfp的构建

4 讨论

参考文献

附录一 英文缩写

附录二 常用培养基和抗生素配制方法

作者简介及科研成果