逐级急性肝损伤大鼠血清TNF-α、IL-6和肝组织HSP70表达变化及其意义

摘要

目的:研究急性肝损伤大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-6和肝组织内HSP70的表达变化,从而为临床探索早期诊断治疗急性肝损伤提供新的思路和理论依据。
　　 方法:10周龄健康雄性SD大鼠适应性饲养一周,随机分为4组(每组10只):A组,假手术组(Group A,n=10)；B组,50％肝切除组(Group B,n=10)；C组,70％肝切除组(Group C,n=10)；D组90％肝切除组(Group D,n=10)。所有大鼠术前禁食12h禁水4h。氯胺酮注射液按150mg／kg剂量大鼠腹腔注射麻醉。麻醉成功后,无菌条件下取肋缘下横切口入腹。按照Kubota T方法改进,采用改良无血切肝术建立模型。开腹后游离肝脏周围组织,暴露大鼠肝脏,游离肝动脉、门静脉和胆道。用近肝门处结扎法沿逆时针方向依次切除相应肝叶。检查无出血后关闭腹腔。参照史冀华等文献方法,SD大鼠50％肝切除方法为顺序切除肝乳头叶、左外叶、三角叶；70％肝切除方法为顺序切除肝左外叶、左内叶、肝中叶；90％肝切除方法为顺序切除肝左叶、肝中叶、肝右后叶、三角叶；对照组即假手术组,开腹后游离肝周韧带,暴露肝脏约20分钟后关腹。参考预实验结果,于24h后称重,在氯胺酮麻醉下采血,取标本,心脏采血应用全自动生化仪测定各组大鼠肝功能指标。双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6、TNF-a。迅速取出完整肝脏称重,计算肝指数即:肝湿质量／大鼠体质量×100％。并在各组大鼠肝脏相同部位切取肝组织1块,置于10％甲醛溶液中固定,制备石蜡切片。石蜡切片,行苏木精-伊红(HE)染色后显微镜下观察肝组织病理改变；免疫组化检测各组肝组织HSP70表达情况,应用Image plus5.0进行图像分析,计算积分光密度值；积分光密度值表示HSP70蛋白表达量。实验数据用均数±标准差((x)±S)表示,采用单因素方差分析,方差不齐者应用H检验,比较各组实验数据的差别；相关性分析应用直线相关分析,认为P<0.05有统计学差异。
　　 结果:实验大鼠40只全部存活。(1)一般情况,各组大鼠术后1天生存率100％。对照组动物精神饱满,灵活好动,进食饮水无明显异常,皮毛光泽度良好；模型组各组大鼠术后各项肝功能指标明显升高,出现不同程度的精神萎靡不振、活动减少、尿色发黄、鼠毛竖立、拒食等状态。90％肝切除模型组术后出现肝功能衰竭的征象,表现为术后苏醒时间延长、嗜睡、对刺激反应弱、眼睛出现血性分泌物、鼠毛脱落、腹壁手术切口渗血、皮肤发黄、尿少色深黄等。(2)HE染色显示,A组肝脏组织无明显异常变化；肝切除各组大鼠肝组织显示广泛肝细胞空泡样变性,细胞肿胀,细胞的泡浆、胞核内出现大小不一的空泡。肝窦明显扩张,散在肝细胞点状坏死,汇管区界限清楚,少量炎性细胞浸润,肝小叶形态完整。D组可见肝细胞胞浆内小空泡相互融合成大空泡,细胞核悬于中央,胞浆空白,细胞形体显著肿大。(3)免疫组化数据采用积分光密度值(IOD)作半定量分析,阳性细胞胞浆或胞核内出现棕黄色颗粒。各模型组与对照组相比较阳性细胞数明显增多,HSP70含量明显升高(P<0.01)。(4)ELISA法检测大鼠血清细胞因子IL-6、TNF-α显示造模24h后各模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平较对照组明显增高(p<0.01),模型组各组组间比较也有显著差异(p<0.01,p<0.05)。
　　 结论:(1)成功建立大鼠逐级急性肝损伤模型,此模型主要表现为各项肝功能指标明显升高,出现不同程度的肝功能损害,肝脏空泡样变性明显,甚至发生点状坏死。(2)急性肝损伤大鼠,血清TNF-α、IL-6水平明显增高且INF-α、IL-6能反映肝组织损伤程度。(3)急性肝损伤大鼠,肝组织中HSP70表达明显增强；且肝脏损伤越重HSP70表达越明显。

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