高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞Bkca对NO敏感性的改变及机制的研究

摘要

目的:高血压(hypertension,HT)是冠心病、脑中风等众多心血管疾病的最大的独立危险因素,对人类健康影响极大,有效的降压可显著降低患者的死亡率。在高血压疾病的进程中,常伴随着血压调节的生理因素的异常,包括交感神经和血管活性物质如一氧化氮(nitric oxide,NO)水平的改变等。小动脉张力增高,外周血管阻力持续升高是高血压的主要表现,其机制至今尚未完全阐明。肠系膜动脉作为人体主要的内脏血管,在全身的动脉中所占比例最大,是形成外周阻力的主要血管,对循环中的活性物质敏感,对血压的调节具有重要意义。大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium—activated potassium channels,BKCa)在血管平滑肌细胞膜上分布广泛,是血管平滑肌上主要的负反馈调节器,在调节血管平滑肌张力机制中起着重要作用。NO是一种内源性的血管舒张因子,也是调节心血管系统功能的重要的细胞信使分子,可通过激活BKCa发挥其调节作用。目前关于NO与心血管疾病关系的研究多集中于高血压时NO分泌量变化的报道,而高血压状态下BKCa对NO的敏感性是否有变化较少报道,深入讨论这些问题对揭示高血压发生的病理生理机制具有重要意义。本实验应用膜片钳单通道电流记录、实时荧光定量PCR和Western blot技术,观察高血压患者肠系膜动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecells,VSMCs)BKCa通道对NO的敏感性变化,以及测定在NO-BKCa通路上与这种变化相关调控因子sGCα、sGCβ和cGKI的mRNA与蛋白表达水平的变化,进一步探讨原发性高血压发生发展过程中可能的离子通道功能变化,为高血压发病机制的阐明提供更多的实验依据。
　　 方法:
　　 (1)膜片钳实验:35例接受腹部手术的患者分为两组:高血压组(hypertension group,HT)20例,血压正常组(normotension group,NT)15例。取其切除的肠系膜动脉,纵向剖开剪成2 mm×2 mm的组织条块,置于酶液中进行两步消化。选取贴壁良好,折光性强,具有较强立体感,表面光滑的平滑肌细胞进行实验。取细胞置于对称性高钾溶液([K+]o:[K+]i=140:140mM)中,用单通道膜片钳技术记录电流,所得电流通过膜片钳放大器(CEZ-2200)放大,滤波(1 KHz)后输入计算机,经pClamp6.0软件采集电流,Clampfit10.1软件系统进行数据分析。在细胞贴附式膜片(cell-attached)和内面向外式膜片(inside-out)上观察NO对BKCa通道的影响,并比较HT组和NT组BKCa通道对NO敏感性的变化。
　　 (2)Real-time PCR实验:
　　 ①32例接受腹部手术的患者分为两组:HT组12例,NT组20例,取其切除的肠系膜动脉作为研究对象；
　　 ②提取肠系膜动脉总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)构建标准品和标准曲线；
　　 ③以GAPDH为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测高血压患者和正常血压患者肠系膜动脉平滑肌sGCα、sGCβ和cGKI基因mRNA水平。
　　 (3)Western blot实验:
　　 ①32例HT组16例,NT组16例,取接受腹部手术患者切除的肠系膜动脉作为研究对象；
　　 ②首先提取肠系膜组织总蛋白并测定样品蛋白浓度,将样品总蛋白上样于预灌制的12％聚丙烯酰胺凝胶中,60V,40分钟,过了浓缩胶后改为120V,40分钟进行电泳,然后恒流(390mA)转印50分钟,5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。次日室温下将膜用sGCα、sGCβ和cGKI-抗孵育5h,洗膜之后用羊抗兔IgG二抗(1:5000)室温孵育1h,最后显色成像,采用Quantity One软件对sGCα、sGCβ和cGKI特异性条带进行半定量分析,同时用GAPDH蛋白的表达量做为内对照。
　　 结果:
　　 (1)急性酶分离的肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道的基本特性:
　　 ①在对称性高钾溶液中,inside—out上,记录到的肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道电导值为200.0±6.97 pS(n=9),具有电压依赖性和钙敏感性。
　　 ②在outside-out下(Vm=+30 mV),200 nM的IbTX几乎能够完全阻断通道活动。
　　 (2)HT组与NT组BKCa通道对NO敏感性变化的比较:
　　 ①在cell-attached(Vm=+40mV)下,给予NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)100μM后NT组BKCa通道开放概率(NPo)由0.007±0.002增至0.015±0.004(n=9,P<0.05),平均开放时间由5.339±1.389(ms)增至10.241±2.290(ms)(n=9,P<0.05),平均关闭时间由1289.492±299.291(ms)缩短至901.174±176.264(ms)(n=9,P<0.05)；给予SNP100μM后,HT组BKCa通道平均开放时间由6.010±1.557(ms)增至9.356±1.482(ms)(n=9,P<0.05),通道开放概率和平均关闭时间均无统计学上差异。电流幅值用药前后无明显变化。
　　 ②在inside—out(Vm=+40 mV)下,给予SNP后NT组BKCa通道开放概率(NPo)由0.004±0.001增至0.014±0.003(n=9,P<0.05),平均开放时间由4.837±0.978(ms)增至6.731±1.555(ms)(n=9,P<0.05)；平均关闭时间由1852.972±587.168(ms)缩短至762.020±213.296(ms)(n=9,P<0.05)。给予SNP100μM后,HT组BKCa通道平均开放时间由8.110±1.99(ms)增至10.271±2.345(ms)(n=9,P<0.05),通道开放概率和平均关闭时间均无统计学上差异。电流幅值用药前后无明显变化。
　　 ③与NT组相比,HT组给予SNP后BKCa通道开放概率增加倍数和平均关闭时间减少倍数均降低。
　　 (3)HT组sGCα、sGCβ和cGKI基因mRNA的变化:
　　 ①总RNA质量:提取的总RNA通过紫外分光光度仪测量,A260／A280在1.80-2.10之间,A260／A230在1.90-2.20之间,浓度大于100 ng／ul,通过1％琼脂糖凝胶电泳得出,28S带和18S带明显,灰度比大于1,5S带不明显,无拖尾；
　　 ②标准曲线和熔解曲线:标准曲线线性关系良好,相关系数R2>0.99。sGCa基因的标准曲线为y=-0.30x+7.28,R2=0.999；sGCβ基因的标准曲线为y=-0.30x+7.44,R2=0.998；cGKI基因的标准曲线为y=-0.29x+7.60,R2=1.000；GAPDH基因的标准曲线为y=-0.30x+7.40,R2=0.999。熔解曲线呈明显单峰状,退火温度与预测值基本一致；
　　 ③HT组和NT组sGCa／GAPDH比值分别为0.1035±0.0322(n=9),0.1843±0.0210(n=15),HT组sGCα基因mRNA水平低于NT组,P<0.05；HT组和NT组sGCβ／GAPDH比值分别为0.0393±0.0064(n=5),0.0712±0.0103(n=8),HT组sGCβ基因mRNA水平低于NT,P<0.05；HT组和NT组cGKI／GAPDH比值分别为0.0271±0.0108(n=8),0.0706±0.0164(n=7),HT组cGKI基因mRNA水平低于NT组,P<0.05；
　　 (4)HT sGCα、sGCβ和cGKI蛋白表达量的变化:
　　 HT组和NT组sGCα、sGCβ和cGKI蛋白的相对表达量分别为0.5510±0.0220(n=15),0.6483±0.0468(n=9):0.4583±0.0209(n=16),0.7690±0.0392(n=15);0.5418±0.1028(n=13),O.6692±0.0249(n=11)；HT组sGCα、sGCβ和cGKI蛋白表达水平低于NT组,P<0.05。
　　 结论:
　　 (1)在cell-attached和inside-out构型上,NO对人肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa均有激活作用。
　　 (2)在cell-attached和inside-out构型上,HT组BKCa通道对NO敏感性降低。
　　 (3)在高血压疾病状态下,NO-BKCa通路上sGCα、sGCβ和cGKI基因mRNA下调。
　　 (4)在高血压疾病状态下,NO-BKCa通路上sGCα、sGCβ和cGKI蛋白表达下调。在高血压疾病状态下NO-BKCa通路上sGCα、sGCβ和cGKI基因和蛋白表达水平的下调可能是引起BKCa对NO的反应性降低的因为。

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结论

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一氧化氮心血管作用的研究进展(综述)

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