拟南芥钙/钙调素信号对WRKY53调控叶片衰老功能的影响

摘要

钙信号是植物信号转导网络的核心成员，钙调素（Calmodulin，CaM）是重要的钙信号转导者之一，通过结合靶蛋白将钙信号传导至下游事件，从而调节植物的生长发育和逆境响应。WRKY53含有一个钙调素结合结构域，研究已表明WRKY53与CaM之间存在互作。拟南芥WRKY53是叶片衰老重要的调控因子，目前关于WRKY53在叶片衰老过程中的功能及其参与的调控网络已有很多报道，但WRKY53作为一个CaM结合蛋白，其功能是否受到Ca2+/CaM信号的调节，仍未见报道。本实验以模式植物拟南芥为研究对象，对Ca2+/CaM信号与WRKY53叶片衰老调控功能的关系展开研究，以期了解 Ca2+/CaM信号通过WRKY53调节叶片衰老的作用机理，扩大我们对Ca2+/CaM调控网络和叶片衰老调控机制的认识。
　　本研究主要内容包括：⑴对AtWRKY53钙调素结合位点（CaMBD）进行三种突变，目的是不改变（mutation1，M1）、减弱（M2）或阻止（M3）WRKY53与CaM的结合能力。成功构建了WRKY53超表达载体和CaMBD突变型WRKY53（WRKY53-M1、WRKY53-M2、WRKY53-M3）的超表达载体。⑵通过农杆菌蘸花侵染的方法转化拟南芥，都获得了阳性转基因植物，并且筛选到了T3代纯合株系。通过定量RT-PCR分析转基因株系中目的基因的表达量，发现目的基因均超量表达。⑶对超表达株系的叶片衰老表型进行分析，发现 WRKY53超表达株系（WK53-OX）、WRKY53-M1超表达株系（WK53-M1-OX）和WK53-M2-OX叶片衰老均比WT更早发生，其中WK53-OX和WK53-M1-OX叶片衰老非常明显，而WK53-M3-OX叶片衰老表型与WT相似。⑷通过定量RT-PCR，分析了WT、wrky53、WK53-OX、WK53-M1-OX、WK53-M2-OX和WK53-M3-OX材料中WRKY53下游所调控的与衰老相关的基因如 WRKY62、SAG12、CAT2和CAT3的表达。发现相比 WK53-OX和WK53-M1-OX，WK53-M2-OX和WK53-M3-OX中这些基因的表达量都明显减少，说明阻止CaM与WRKY53的结合可能影响了WRKY53对下游基因的调控。以上结果说明CaM的结合在WRKY53调控叶片衰老中有重要作用。

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1 文献综述

1.1 钙/钙调素信号转导系统

1.2 WRKY转录因子

1.2.1 WRKY的结构分类及其生物学功能

1.2.2 钙/钙调素调控WRKY转录因子的研究进展

1.3 WRKY53与植物叶片衰老

1.3.1 植物叶片衰老的调控机制

1.3.2 WRKY53调控叶片衰老功能的研究进展

1.4 本研究的内容和意义

2 AtWRKY53超表达载体及CaMBD突变体的构建

2.1 材料与试剂

2.1.1 材料

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 AtWRKY53超表达载体的构建

2.2.2 WRKY53 CaMBD的突变及其过量表达载体的构建

2.2.3 转基因株系的筛选与培养

2.2.4 超表达效果的检测

2.3 结果与分析

2.3.1 WRKY53超表达载体的构建

2.3.2 WRKY53 CaMBD的突变及其过量表达载体的构建

2.3.3 转基因株系的筛选与培养

2.3.4 qRT-PCR检测超表达效果

2.4 讨论

3 CaMBD突变对AtWRKY53调控叶片衰老功能的影响

3.1 材料与试剂

3.1.1 材料

3.1.2 试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 拟南芥叶片衰老表型的观察

3.2.2 qRT-PCR对AtWRKY53下游基因的表达检测

3.3 结果与分析

3.3.1 CaMBD不同突变型的过量表达对叶片衰老的影响

3.3.2 CaMBD的突变对WRKY53下游基因表达的影响

3.4 讨论

4 展望

参考文献

附录一：主要中英文缩写：

附录二：常用培养基和抗生素的配制：