嗜热光合细菌Roseiflexus电子传递复合体ACⅢ亚基的克隆、纯化和初步结晶

摘要

在嗜热不放氧光合细菌Roseiflexus的光合电子传递链中缺少了细胞色素bc1复合体，取而代之是一种叫做ACⅢ的新型细胞色素复合体。该复合体在光合电子传递链中的作用是氧化甲基萘醌和还原金色蓝素，形成循环电子传递。现已确认ACⅢ是一个多亚基的蛋白复合体，也存在于其它多种光合和非光合的细菌中。前期研究表明ActE亚基是该蛋白复合体的一个关键亚基，在ACⅢ蛋白复合体的整体结构和功能中的作用尚未明确。为了更深入理解ACⅢ复合体的结构，阐明ACⅢ复合体在光合电子传递链中的工作机制，需要深入研究各个亚基蛋白的结构和功能。
　　本文采用分子生物学和蛋白质化学方法对ActE亚基蛋白展开如下实验：⑴调整了光合玫瑰菌的培养条件，提高了大规模培养细胞的产量；⑵优化了去垢剂增溶处理的条件，从差速离心得到的膜组分中，获得了最好的提取效果，并且采用离子交换层析和凝胶过滤等方法分离纯化了ACⅢ蛋白复合体；⑶以Roseiflexus castenholzii基因组为模板，根据JGI数据库中的ActE基因序列设计特异性引物，经过PCR扩增后，将ActE基因的目的片段重组到新型表达载体pEASY-E1上，最终成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达；⑷通过亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法分离与纯化了ActE亚基融合蛋白；⑸将纯化得到的以上两种蛋白质进行三维晶体生长条件的筛选。本研究将为ACⅢ蛋白复合体结构和功能的进一步研究提供了理论基础。

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第1章 引言

1.1光合细菌的概述

1.2蛋白复合体ACⅢ概述

1.3论文研究意义和技术路线

第2章 ACⅢ蛋白复合体纯化方法的优化

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4小结与讨论

第3章 actE的克隆和载体构建

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4小结与讨论

第4章 亚基蛋白ActE的表达与纯化

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4小结与讨论

第5章 纯化蛋白的三维结晶条件筛选

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3实验结果及分析

参考文献

附录

缩略语