不同龋敏感儿童口腔变异链球菌临床分离株与HtrA关系的实验研究

摘要

目的:龋病是一种严重危害人类身体健康的最常见的口腔疾病,乳牙龋是儿童口腔中的常见病和多发病,本研究在前期实验的基础上,对不同龋敏感儿童口腔变异链球菌临床分离株HtrAmRNA和蛋白质的表达情况进行探讨,分析不同致龋性菌株HtrA表达的差异,获得乳牙龋坏程度和HtrA的关系,为完善龋危险性预测方法提供有力的理论和实验依据。
　　 方法:以前期实验获得的具有不同基因核型的高龋,龋失补指数(decayed,missing,filled teeth index,dmft)≥6、中龋,6>dmft≥14,无龋,dmft=0共111株变异链球菌中选取其中45株(其中高龋组15株,中龋组15株,无龋组15株)为实验菌株,以国际标准菌株变异链球菌(S.mutans)ATCC25175(血清型C)为阳性对照,于轻唾琼脂(MS)平板复苏,涂片检查为纯培养后,取典型菌落接种于牛心脑浸液(Brain Heart Infusion,BHI)中,37℃厌氧(80％N2、10％H2、10％CO2)培养24h,分离纯化核酸,采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)法,提取变异链球菌临床分离株总RNA,用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,合成cDNA并取cDNA产物进一步进行PCR.扩增,反应结束后将扩增产物进行2.0％的琼脂糖凝胶电泳,以DL500 DNA Marker为分子量参照标准,凝胶成像系统下观察记录结果,将所得的目的基因HtrA及内参的电泳图像利用凝胶定量分析软件Gel-Pro analyzer4.0进行灰度扫描,分析计算基因相对表达值,采用蛋白质印迹(Western Blot)法,提取变异链球菌临床分离株总蛋白,检测总蛋白样品浓度,聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离,考马斯亮蓝染色后转膜,加入5％脱脂奶粉,室温封闭1h后杂交,化学发光显影,结果用Bio-Rad凝胶摄像分析系统扫描入计算机中,凝胶定量分析软件Quantity One4.4.0分析其灰度值,蛋白的相对表达水平。
　　 结果:1.高龋、中龋及无龋儿童口腔变异链球菌临床分离株HtrA mRNA表达存在差异,高龋组>中龋组>无龋组,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.高龋、中龋及无龋儿童口腔变异链球菌临床分离株HtrA蛋白的表达也存在差异,高龋组>中龋组>无龋组,差异具有统计学意义(p<0.05)。
　　 结论:1.不同龋敏感儿童口腔变异链球菌临床分离菌株HtrA mRNA表达存在差异,龋敏感性越高,HtrAmRNA表达越高。2.不同龋敏感儿童口腔变异链球菌临床分离菌株HtrA蛋白表达存在差异,龋敏感性越高,HtrA蛋白表达越高。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 不同龋敏感儿童变异链球菌临床分离株HtrA mRNA的表达

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 不同龋敏感儿童变异链球菌临床分离株HtrA蛋白的表达

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

变异链球菌基因组和蛋白质组研究进展(综述)

参考文献