应用分子生物学和蛋白组学技术快速鉴定金黄色葡萄球菌

摘要

金黄色葡萄球菌是分布最广泛的致病菌之一,它分泌多种毒力因子[1],可导致肺炎,伤口感染及食物中毒等严重疾病,占医院感染病例的10％。近年来,随着抗生素的广泛应用,导致了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的大量出现,使其成为与艾滋病、乙型肝炎并列的世界三大感染顽疾。传统的检测方法具有操作简便,所需设备简单的优点,但都存在耗时长、灵敏性差的缺点。随着分子生物学技术和蛋白组学技术的广泛应用,对金黄色葡萄球菌的检测也从传统方法过渡到以PCR、杂交探针、基因芯片和MS为主的现代技术上,从基因和蛋白质水平更准确、更灵敏的检测病原菌的存在。本研究首先采用PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析)鉴定了临床常见的葡萄球菌,然后利用差异蛋白组学的方法,运用SELDI-TOF-MS质谱技术检测金黄色葡萄球菌以及其他对照组细菌的蛋白指纹图谱,并筛选出金黄色葡萄球菌的特异表达蛋白标志物,建立决策树预测模型,探讨其用于金黄色葡萄球菌实验室诊断的临床价值。
　　 目的：
　　 细菌分子水平的鉴定是目前临床实验室微生物领域研究的一个热点。本研究利用聚合酶链反应-限制片段长度多态性分析技术和差异蛋白组学技术快速鉴定临床常见的金黄色葡萄球菌,为临床微生物鉴定方法的研究奠定了基础。
　　 方法：
　　 1.采用四种DNA提取方法提取金黄色葡萄球菌DNA,筛选适宜的DNA提取方案。2.PCR扩增金黄色葡萄球菌的16SrDNA,产物测序,结果与GenBank比对进行鉴定。3.获取葡萄球菌tuf基因序列,通过软件分析tuf基因的酶切位点和酶切模式。优化PCR检测tuf基因的反应条件,采用PCR扩增葡萄球菌tuf基因,产物经限制性内切酶AluI,HinfI酶切后,琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物,根据酶切模式对葡萄球菌进行鉴定。4.选择不同激光强度,探讨并建立SELDI-TOF-MS检测细菌蛋白指纹图谱的条件。5.收集培养24h、48h、72h的金黄色葡萄球菌,SELDI-TOF-MS检测其蛋白指纹图谱,分析培养时间对蛋白指纹检测的影响。6.将3株金黄色葡萄球菌均重复检测20次,分析SELDI-TOF-MS检测细菌蛋白指纹的重复性。7.选取60株金黄色葡萄球菌和84株对照细菌为训练集,56株金黄色葡萄细菌和75株对照细菌为验证集,采用SELDI-TOF-MS检测训练集和验证集细菌蛋白指纹图谱。利用Biomarker Wizard软件筛选金黄色葡萄球菌特征性蛋白,通过Biomarker Pattems软件建立金黄色葡萄球菌决策树诊断模型。8.利用验证集中56株金黄色葡萄球菌和75株对照细菌蛋白指纹图对建立的诊断模型进行盲法验证。
　　 结果：
　　 1.四种DNA提取方法中,只有改良NaOH方法能成功提取金黄色葡萄球菌DNA。2.所有金黄色葡萄球菌均能扩增出16SrDNA,PCR扩增产物测序结果与GenBank的金黄色葡萄球菌序列比对,相似性均大于99.5％。3.软件分析发现,葡萄球菌tuf基因具有AluI,HinfI等多个酶切位点,tuf基因经过.AluI,HinfI酶切的产物具有特征性,可将不同的葡萄球菌区分开。实验发现,在优化的PCR反应条件下,不同的葡萄球菌均能扩增出668bp的产物。PCR产物经过AluI,HinfI酶切后,琼脂糖凝胶电泳结果显示,酶切结果与理论相符,并能区分金黄色葡萄球菌。4.不同激光强度下,细菌蛋白指纹图谱略有差异,以激光强度为190检测结果最佳。5.金黄色葡萄球菌经培养24h、48h、72h后,SELDI-TOF-MS质谱检测发现,培养时间对于细菌蛋白的表达有一定影响,同时也发现有多个蛋白标志物在不同时间均稳定表达。6.金黄色葡萄球菌重复检测20次,6个特征蛋白峰的分子量变异系数均≤0.05％,提示SELDI-TOF-MS检测葡萄球菌特征性蛋白具有很好的重复性。7.SEILDI-TOF-MS检测结果显示,所有金黄色葡萄球菌均具有相似的蛋白指纹图谱,在分子量3000-20000Da范围内共检测到75个蛋白质峰,其中47个蛋白质峰差异具有统计学意义(P<0.001),其中以质荷比(M／Z)为13113、4458的2个蛋白的差异最明显。利用Biomarker Patterns软件建立了一种金黄色葡萄球菌决策树分类鉴定模型。8.盲法验证结果表明,该分类鉴定模型对金黄色葡萄球菌诊断灵敏性和特异性均为100％。
　　 结论：
　　 本研究成功建立了一种可区分不同葡萄球菌的PCR-RFLP方法。同时采用SELDI-TOF-MS技术构建了多种细菌的蛋白指纹图谱,利用Biomarker Patterns软件建立了一种金黄色葡萄球菌的蛋白决策树分类鉴定模型,开创了一种分子水平上的新模式,为金黄色葡萄球菌的快速诊断鉴定了基础。

目录

文摘

英文文摘

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材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

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致谢

临床常见腹泻致病菌的快速鉴定方法研究进展综述

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