利妥昔单抗对实验性变态反应性脑脊髓炎的作用机制研究

摘要

目的：通过观察利妥昔单抗(RTX)对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠发病情况、中枢神经系统病理改变、外周血中B细胞含量变化以及脑组织中白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17(IL-17)、γ-干扰素(IFN-γ)的含量变化,探讨RTX对EAE的治疗作用及其可能的免疫学机制,为RTX治疗多发性硬化(MS)寻找充分的理论依据。方法：1.分组、造模及给药:采用粗制碱性髓鞘蛋白(CMBP)加福氏完全佐剂(CFA)皮下注射的方法建立 EAE模型,EAE模型分为 RTX治疗组和EAE对照组,每组10只;正常对照组10只,按EAE模型组的方法注射生理盐水及CFA。自造模当日开始给药,EAE治疗组腹腔注射RTX(200μg/只/天),连续治疗3天,正常对照组及EAE组腹腔注射生理盐水0.3ml/d。于EAE对照组、RTX治疗组连续3天症状评分无加重或四肢瘫痪、死亡时作为 EAE发病高峰期处死发病大鼠,濒死大鼠在尚有心跳、体温时处死,其余至观察8周结束时全部处死。2.观察大鼠发病情况、潜伏期、进展期和高峰期神经功能障碍评分及死亡率的变化。3.采用光镜观察各组大鼠脑及脊髓组织病理变化。4.采用流式细胞仪计数外周血B细胞数。5.采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测脑组织匀浆中IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ的含量。6.将EAE组及RTX组各指标进行相关性分析。7.所有数据采用SPSS17.0进行统计分析。结果：1.大鼠发病情况:(1)临床症状:正常对照组大鼠无异常表现;EAE对照组及RTX治疗组所有大鼠均发病,潜伏期10-30天不等,发病大鼠先后出现进食减少、体重下降、萎糜、后肢无力、自伤后肢、后肢完全不能活动等表现,严重者四肢瘫痪、抽搐,甚至死亡。(2)潜伏期变化:RTX治疗组的潜伏期较EAE对照组延长(P<0.05);(3)进展期变化:RTX治疗组进展期与EAE对照组相比明显缩短(P<0.05)。(4)发病高峰期神经功能障碍评分变化:RTX治疗组发病高峰期神经功能障碍评分较EAE对照组明显降低(P<0.05)。2.脑及脊髓病理变化:EAE对照组及RTX治疗组大鼠的脑和脊髓都出现了EAE典型的病理改变,小血管周围炎性细胞浸润,呈袖套状的改变,血管周围白质明显的脱髓鞘改变。RTX治疗组脱髓鞘改变及炎性细胞浸润较EAE对照组减轻。3.外周血B细胞数变化:EAE组大鼠外周血 B细胞数较正常对照组明显升高(P<0.05);RTX治疗组大鼠外周血 B细胞数较正常对照组明显降低(P<0.05);RTX治疗组大鼠外周血B细胞数显著低于EAE组(P<0.01)。4.脑组织匀浆中IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ的含量:EAE对照组、RTX治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10含量均较正常对照组明显降低(P均<0.01);EAE组脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量显著低于RTX治疗组(P均<0.05);EAE对照组、RTX治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量均较正常对照组明显升高(P均<0.01);EAE组脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量显著高于 RTX治疗组(P均<0.05)。5.相关性分析:①EAE对照组及RTX治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量与潜伏期呈明显负相关(P<0.05或 P<0.01);EAE对照组及RTX治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与潜伏期呈明显正相关(P均<0.01)。②EAE对照组及RTX治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量与进展期呈明显正相关(P均<0.01);EAE对照组及RTX治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与进展期呈明显负相关(P均<0.01)。③EAE对照组及RTX治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量与高峰期神经功能障碍评分呈明显正相关(P<0.05或 P<0.01);EAE对照组及RTX治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与高峰期神经功能障碍评分呈明显负相关(P<0.05或P<0.01)。④EAE对照组及RTX治疗组大鼠外周血B细胞数、脑组织匀浆中IL-17、IFN-γ的含量与 HE染色病理评分呈明显正相关(P<0.05或 P<0.01);EAE对照组及RTX治疗组大鼠脑组织匀浆中IL-4、IL-10的含量与 HE染色病理评分呈明显负相关(P<0.05或P<0.01)。结论：1.采用多点皮下注射WSCH+CFA诱导Wistar大鼠,建立EAE模型,EAE大鼠神经功能障碍明显,脑血管周围炎性细胞浸润,说明Wistar大鼠复制的急性EAE模型成功,模型稳定、可靠。2.RTX能延长 EAE大鼠发病潜伏期、缩短 EAE发病进展期、减轻EAE大鼠神经功能障碍、降低EAE动物的死亡率、减轻EAE大鼠病理损害,对EAE发病具有保护作用。3.RTX可能主要是通过降低EAE大鼠外周血B细胞数,使外周血B细胞数耗竭,从而起到治疗EAE的作用;RTX也可通过减低EAE大鼠分泌IL-17、IFN-γ的量和上调IL-4、IL-10的含量,从而对EAE大鼠达到保护作用。4.RTX通过清除EAE大鼠外周血B细胞而起到治疗EAE的作用，因此，监测外周血B细胞可能有助于指导RTX用药。

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 取材

4病理检查

5 统计学的处理

结果

1 EAE对照组和RTX治疗组大鼠发病情况：

2 脑和脊髓的病理变化：

3 外周血B细胞数变化

4. 脑组织匀浆中IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ的含量

5. 相关性分析

讨论

1 EAE动物模型的选择、建立与评价

2. B细胞在EAE发病机制中的作用

3 细胞因子在EAE中的作用机制

4.IL-17在EAE中的作用

5. RTX在EAE中的作用评价

6. RTX治疗EAE的作用机制

结论

参考文献

B细胞与多发性硬化综 述

1、B细胞的分化与活化

2、CNS内的B细胞聚集

3、B细胞和抗体介导的MS的免疫损伤

4、B细胞清除治疗

5、展望

参考文献