PDLSC体外分离培养及20-Hydroxyecdysone对PDLSC 增殖和成骨分化作用的研究

摘要

20-羟基蜕皮甾酮(20-Hydroxyecdysone,20E)是蜕皮类固醇激素中的一员,能够促进间充质干细胞成骨分化。人牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSC) 来源于人牙周膜细胞(Periodontal ligament cells,PDLC),具有间充质干细胞的特性, PDLSC 被视为临床中治疗牙周炎的候选之一。然而,目前还没有关于20E对PDLSC作用的研究。目的：讨论应用组织块法、酶消化法、酶解组织块法3种方法体外分离培养人PDLC的优点及缺点；研究PDLSC体外分离、鉴定和诱导分化；研究20E在体外对PDLSC增殖、ALP活性和成骨分化的作用。方法：1、分别应用组织块法、酶消化法、酶解组织块法 3 种方法培养 PDLC。应用有限稀释法克隆化培养、分离纯化得到 PDLSC ,应用克隆形成实验检测克隆形成率；为描述单克隆得到的PDLSC的干细胞表型标记,应用流式细胞技术检测表面标志物STRO-1、CD146和CD45的表达；为检测PDLSC的多向分化能力,应用成骨诱导液、成脂诱导液诱导 PDLSC 成骨、成脂分化。2、 将PDLSC以5×103个/ml的浓度,每孔200ul DMEM,接种于96孔板培养。培养24 h以后,弃掉原来的培养液, 分别加入含有0、50、100、200、400uM 的 20E 的培养液,这些细胞随后再被培养 1-10 天。在1-10d的同一时点,采用MTT法检测对其体外增殖能力的影响。最后,在酶联仪上检测吸光密度(OD)值。3、将PDLSC以 5×105 /ml的浓 度,接种于12孔板。当细胞达80%汇合以上时,分别加入含有0、50、100、200uM的 20E的培养液,然后于1、3、7天后终止培养。用裂解液裂解细胞,细胞内碱性磷酸酶用 pNPP 法检测。4、将 PDLSC 以5×105个/ml的浓度,每孔1mlDMEM,接种于96孔板培养。培养24 h以后,弃掉原来的培养液,用加入或不加入 20E( 200 uM)的培养液培养细胞。3天后应用real-time PCR分析RUNX2 的表达。应用SPSS13.0软件分析以上数据,并用均数±标准差( x ± SEM)表示。两个样本均数比较应用独立样本的t检验；先应用方差分析(ANOVA),再应用SNK法,检验多个样本的两两比较, 当P<0.05时,表示差异有统计学意义。结果： 1、应用组织块法分离培养 PDLC的成功率为53%；应用酶消化法分离培养 PDLC 的成功率为 40%,应用酶解组织块法分离培养 PDLC的成功率为60%。应用有限稀释法所得到的细胞克隆形成率为 18.29%。经流式细胞术检测,有限稀释法所得到的细胞表达的STRO-1、CD146 较高,相反,表达的CD45较少。在特定的条件下, PDLSC 能在体外进行成骨、成脂分化。2、第 1 天对照组与实验组各组OD值无统计学差异(P>0.05),2-10天各组OD值有统计学差异(P<0.01),400uM组OD值低于对照组,低浓度组(50, 100, 200uM) OD 值高于对照组,且 OD 值随 20E 浓度增高而增高。3、第 1、3、7天各组间 ALP 活性有统计学差异(P<0.01),且实验组(50, 100, 200uM)均高于对照组,且ALP活性随20E浓度增高而增高。4、3天后实验组和对照组 RUNX2 mRNA 表达有统计学差异(P<0.01),且实验组mRNA 表达高于对照组。
结论：1、原代培养人PDLC,酶解组织块法成功率较高。应用有限稀释法所得到的细胞有较高的克隆形成能力。PDLSC有多向诱导分化能力。2、400 uM的20E有细胞毒性,抑制PDLSC增殖,而低浓度的20E (50, 100, 200uM)促进DLSC增殖,且具有剂量依赖性。3、20E促进PDLSC 的ALP活性,且具有剂量依赖性。4、20E促进PDLSC 的成骨分化。

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英文摘要

前言

实验一 人牙周膜干细胞的体外分离培养及多向诱导分化

材料和方法

结果

讨论

实验二 20-Hydroxyecdysone对PDLSC增殖和成骨分化作用的研究

材料与方法

结果

讨论

全文小结

本研究不足之处

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

综述