乙型肝炎肝硬化患者FoxP3 mRNA表达及血清IL-12、 IL-18水平的变化

摘要

目的：慢性乙型肝炎病毒感染的发病机制与机体免疫反应关系密切,近年来关于CD4+CD25+Treg细胞在HBV感染者中的功能和作用,日益成为研究的焦点。明确Treg细胞对效应T细胞及相关细胞因子的免疫耐受状态的调控机理,对于有效终止病毒持续感染具有重要意义。FoxP3是目前公认的CD4+CD25+Treg细胞的最具特异性的转录因子,通过检测FoxP3 mRNA的表达情况,可准确反映 CD4+CD25+Treg 细胞的活性水平。本实验旨在初步探讨慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者 FoxP3 mRNA 表达及血清中IL-12、IL-18 水平变化及其意义,并分析外周血FoxP3 mRNA表达与血清IL-12、IL-18水平的相关关系,以及外周血FoxP3 mRNA表达、血清IL-12、IL-18水平与病毒载量的相关关系。方法：1.提取健康对照组、慢性乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组新鲜血液中的总RNA,逆转录成cDNA；实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)扩增检测健康对照组、慢性乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组FoxP3 mRNA的表达水平,并分析外周血FoxP3 mRNA表达与病毒载量的相关关系。2.采用 ELISA 方法测定健康对照组、慢性乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组血清的IL-12、IL-18水平,并分析血清IL-12 、IL-18水平与病毒载量的相关关系。3.分析健康对照组、慢性乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组三组研究对象FoxP3 mRNA表达及IL-12 、 IL-18水平的变化及其相关关系。4.分别测定并分析健康对照组、慢性乙型肝炎组、乙型肝炎肝炎肝硬化组的血清学指标,包括ALT、AST、ALB、PTA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBV-DNA 定量。结果：1.慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化组的FoxP3 mRNA表达及IL-12、 IL-18水平,和正常健康组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；2.进一步两两比较：健康对照组与乙型肝炎肝硬化组、健康对照组与慢性乙型肝炎组组间FoxP3的Mann-Whitney U值为0.000,两组间有统计学差异(p=0.000, P<0.05)；慢性乙型肝炎与乙型肝炎肝硬化组组间：Mann-Whitney U值为225.500,两组间无统计学差异(p=0.189,p>0.05)；健康对照组与乙型肝炎肝硬化组 IL-12 的 Mann-Whitney U 值为 24.000,差异有统计学差异(p=0.000,p<0.05)；健康对照组与慢性乙型肝炎组Mann-Whitney U值为12.000,( p=0.000,p<0.05)组间有统计学差异；慢性乙型肝炎与乙型肝炎肝硬化组间：Mann-Whitney U 值为 264.000,两组无统计学差异( p=0.597 , p>0.05 )；健康对照组与乙型肝炎肝硬化组 IL-18 的Mann-Whitney U值为7.000,组间有统计学差异( p=0.000,p<0.05)；健康对照组与慢性乙型肝炎组：Mann-Whitney U值为36.000 ,组间有统计学意义( p=0.025,p<0.05)；慢性乙型肝炎与乙型肝炎肝硬化组：Mann-Whitney U值为223.000,两组无统计学差异( p=0.173,p>0.05)。3.采用 Spearman 相关系数方法对慢性乙型肝炎感染者 FoxP3 mRNA 与IL-12、IL-18水平作相关性分析,FoxP3 mRNA与IL-12(r=-0.297,P=0.059),两者水平无相关关系；FoxP3 mRNA与IL-18(r=-0.242,P=0.078) ,两者水平无相关关系；4. 采用 Spearman 相关系数方法对慢性乙型肝炎感染者IL-12与IL-18作相关性分析(r=0.828,p=0.000),两者之间呈正相关关系。5. 采用 Spearman 相关系数方法对慢性乙型肝炎感染者病毒载量与 FoxP3mRNA水平作相关性分析：HBV-DNA与FoxP3 mRNA (r=0.830,P=0.031) ,两者之间呈正相关关系；采用Spearman相关系数方法对慢性乙型肝炎感染者病毒载量与血清 IL-12、IL-18 水平作相关性分析：HBV-DNA 与IL-12(r=-0.459 , P=0.000)、HBV-DNA 与 IL-18(r=-0.328 , P=0.015) , HBV-DNA与IL-12和IL-18两者水平为负相关关系,即随着IL-12、IL-18的升高HBV-DNA呈现下降的趋势。结论：1.本实验发现,慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者外周血FoxP3 mRNA表达高于健康对照组(P<0.05),并且与 HBV-DNA 载量呈正相关关系,表明 FoxP3 mRNA 的异常升高(即CD4+CD25+Treg细胞活性增强) 抑制了效应性T细胞免疫反应,导致机体的免疫应答能力下降产生免疫耐受,使 HBV 不能被有效清除引起持续的感染,促使疾病向慢性化方向发展,其机制可能为慢性病毒性肝炎患者体内的炎性反应,产生一些细胞因子刺激Treg细胞的增生而引起FoxP3 mRNA的表达异常。2.慢性乙肝患者血清细胞因子 IL-12、IL-18 的异常升高可能是Th1/Th2细胞失平衡的结果,在乙型肝炎慢性化的进程中发挥作用,参与了病毒性肝炎肝炎肝硬化患者的肝脏炎性损伤的过程。3. 在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者中病毒载量与血清中细胞因子IL-12、IL-18为负相关关系,表现为随着血清中细胞因子IL-12、IL-18的升高出现病毒载量的下降。由于细胞免疫的增强,有利于病毒的清除,与此同时由于Th1细胞占优势,增强了 CD8+T 细胞的活性,也会进一步加重肝细胞的损伤；由此可见IL-12、IL-18参与了机体对HBV的免疫清除过程。4.本研究发现,外周血 FoxP3 mRNA 与血清 IL-12、IL-18 之间并没有相关关系。因此关于FoxP3 与细胞因子IL-12、IL-18的关系还有待进一步更深入的研究。

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前言

材料与方法

1实验对象

2.主要实验试剂

3主要实验器材

4、实验主要耗材

5、实验方法

6．统计分析

结果

1 、慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者及健康对照组FoxP3 mRNA的表达：

2、各组FoxP3 mRNA、IL-12、IL-18 Kruskal-Wallis H检验分析结果

3、各组FoxP3 mRNA、IL-12、IL-18两两比较分析结果:

3、乙型肝炎、肝炎肝硬化患者及健康对照组IL-12含量的比较：

4、乙型肝炎、肝炎肝硬化患者及健康对照组IL-18含量的比较：

5、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者及健康对照组FoxP3 mRNA的表达与IL-12、IL-18的相关性分析：

6、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者及健康对照组病毒载量与FoxP3 mRNA IL-12、IL-18的相关性分析：

讨论

结论

参考文献

英汉缩词对照表

致谢

综述

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