PKCβ/p66Shc氧化应激通路对高氧诱导人肺泡上皮细胞凋亡的作用

摘要

目的：探讨PKCβ/p66Shc氧化应激通路介导高氧诱导人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞凋亡的作用,探讨PKCβ抑制剂LY333531对高氧诱导肺泡上皮细胞的保护作用。
　　方法：本实验是将体外传代培养的人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞系(A549细胞)作为研究对象。以高体积分数氧(高氧)诱导人A549细胞模型为基础,以3L/min的速度通入含有95％氧气的高纯混合气处理细胞。将实验细胞A549随机分为三组:对照组、高氧组,LY333531组。对照组:加入含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基中常规培养;高氧组:加入等量的上述培养液,换液后,通入3L/min的90%氧气和5%二氧化碳高纯混合气10min,在培养箱中密闭培养;LY333531组:用终浓度为10μmol/L的等量PKCβ特异性抑制剂LY333531的培养液预处理A549细胞24h后,再用高氧诱导A549细胞,10分钟后密闭培养。培养结束后收集细胞检测以下指标:倒置相差显微镜下观察A549细胞的形态学改变并照相;流式细胞术检测高氧及LY333531对A549细胞凋亡率的影响;采用SP细胞免疫化学方法检测分组24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表达;WesternBlot检测24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表达;激光共聚焦显微镜检测分组24小时后P66Shc在线粒体内的转位;激光共聚焦显微镜检测分组24小时后线粒体活性氧簇产生的情况;激光共聚焦显微镜检测分组24小时后线粒体膜电位的变化。
　　结果：(1)倒置显微镜下,细胞生长状态良好,呈扁圆多角形,数量多,排列紧密,连接成片,悬浮细胞较少。高氧组生长状态较差,细胞形态由典型的扁圆多角形细胞变成圆形或椭圆形,间隙增加,连接松散,活细胞数量明显降低,悬浮细胞数量明显增多。LY3333531组生长状态欠佳,活细胞数量较高氧组增多,悬浮细胞数较高氧组减少,但是未达到对照组的水平;(2)流式细胞术结果显示:高氧组与对照组相比,细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而LY3333531组的凋亡率有所降低,与高氧组相比差异有统计学意义(P<0.05);(3)免疫组化结果显示,与对照组相比,高氧组24h后A549细胞内PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表达均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与高氧组相比,LY3333531组Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)western-blot结果显示,与对照组相比,高氧组24小时后A549细胞内PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表达均明显著增加,差异有显著性(P<0.05)。与高氧组相比,LY3333531组Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表达明显降低,差异有显著性(P<0.05)。(5)激光共聚焦显微镜结果显示:与对照组相比,高氧组细胞p66Shc蛋白的转位率明显增加,差异有显著性(P<0.05),与高氧组相比,LY3333531组转位率明显降低,差异有显著性(P<0.05)。(6)激光共聚焦显微镜结果显示:线粒体ROS呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光。正常对照组红色荧光仅有微弱表达;与对照组相比,高氧组细胞红色荧光含量显著增加,差异有显著性(P<0.05);LY333531组
　　红色荧光含量较高氧组有所减少,差异有显著性(P<0.05),但未减少至对照组水平(P<0.05)。(7)激光共聚焦显微镜结果显示:与对照组相比,高氧组线粒体膜电位△Ψm明显下降,差异有显著性(P<0.05);与高氧组相比,LY333531组线粒体膜电位升高,差异有显著性(P<0.05),但未达到对照组水平(P<0.05)。
　　结论：高氧能诱导肺泡上皮细胞的损伤,能导致凋亡的发生。其具体的机制为高氧气能诱导细胞内内PKCβ表达增多,进而Pin1、p66Shc表达增多,发生磷酸化,然后转位于线粒体,线粒体ROS产生增多,线粒体膜电位△Ψm下降。相反,PKCβ抑制剂LY333531能抑制PKCβ蛋白的表达,进而减少Pin1、p66Shc、p66Shc-Ser36蛋白表达,减少p66Shc的转位,减少线粒体ROS的产生,减轻△Ψm下降,从而减少A549细胞凋亡来明显减轻高氧诱导的人肺泡上皮细胞的损伤。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料、实验试剂、主要实验仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器：

4 实验方法与分组

5 统计学处理

结果

1 倒置相差显微镜观察LY333531对高氧诱导A549细胞形态学改变

2 免疫组化方法检测LY333531对高氧诱导的A549细胞内PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表达的影响

3 Western-blot检测LY333531对高氧诱导的A549细胞内 Pin1/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36表达的影响

4 激光共聚焦显微镜观察P66Shc在线粒体内的转位率

5 线粒体活性氧簇产生

6 线粒体膜电位的变化

7 细胞凋亡率比较

附图

讨论

1 高氧诱导肺泡上皮细胞损伤可能的机制

2 PKCβ/p66Shc介导高氧性人肺上皮细胞凋亡作用及可能机制

3 研究意义

结论

参考文献

英文缩写及中英文对照

活性氧（ROS)稳态和在细胞信号传导中的氧化还原调控作用

攻读硕士学位期间发表和撰写的论文