大鼠肾移植后肝、心和脑组织中排斥反应相关细胞因子的分子生物学研究

摘要

本文研究肾移植受体大鼠肝脏、心脏和脑组织中排斥反应相关细胞因子的分子生物学变化，探讨肝、心和脑组织损伤在机体排斥反应中的因果关系，为防治肾移植后肝、心、脑组织的损伤奠定基础。 方法：首先，通过总结108例临床肾移植成功病例资料，回顾分析对比总体与其中24例发生急性排斥反应后出现肝、心、精神并发症者的发生率有无差异。其次，建立大鼠肾移植动物实验模型。取大鼠70只，随机分为对照组10只、实验组60只（供体30只，受体30只），供?受体均在术前禁食12小时，10％水合氯醛35mg/100g体重腹腔麻醉?在相对无菌条件下实施异体肾移植术，移植后10天手术取出大鼠心肝脑组织。主要观测指标：（1）组织病理学观察肾移植后肝、心和脑组织的镜下变化。（2）应用免疫组织化学技术检测移植肾大鼠的心、脑、肝组织中排斥反应相关的炎症趋化相关因子RANTES、INF-γR、INF-γ的表达；MMP-2、TIMP-2的改变；以及排斥反应所致组织细胞凋亡的相关因子Fas、Fas-L、Perforin、Granzyme B的变化，从排斥反应相关细胞因子的分子生物学水平探讨肾移植后肝、心和脑组织出现的变化。（3）应用原位杂交技术检测IL-2mRNA探针、IL-6mRNA探针、INF-γmRNA探针的变化，进一步从转录水平探讨肾移植后肝、心和脑组织出现的变化。 结果： 临床病例分析（1）在发生急性排斥反应的24例临床肾移植患者中，有9例术后发生肝功能异常，其与未发生排斥组术后肝功能异常发生率统计学比较（P<0.05），差异具有统计学意义，表明急性排斥反应与肝脏的损伤有相关性。（2）在发生急性排斥反应的24例中早期有15例BP超过170/95mm Hg，其中有3 例出现不同程度心衰，有5例患者HR>100次/min，6例出现频发室性早搏。（3）4例患者出现精神异常，例1～例3术后第24～30天神志恢复正常，出院时移植肾功能正常，随访1年例1及例3遗留轻度视力下降，例4第18天因小肠穿孔行坏死段小肠切除端端吻合术后恢复。 组织学变化：（1）大鼠肾移植后肝脏的组织学变化，对照组：汇管区少许炎细胞浸润，余正常；实验组：炎细胞浸润，中央静脉血管轻度扩张充血；小叶结构基本正常，肝细胞轻度水肿。（2）大鼠肾移植后心脏的组织学变化，对照组：间质轻度水肿，余未见异常；实验组：间质水肿，血管见扩张。（3）大鼠肾移植后脑组织学变化，对照组：未见异常变化；实验组：间质轻度水肿，血管见扩张。表明：移植肾后大鼠肝、心、脑组织在一定时期内病理改变不明显。 排斥反应相关细胞因子的变化：（1）炎性反应相关因子 大鼠肾移植后肝、心、脑组织中炎性损伤相关因子INF-γR、INF-γ、RANTES的表达，实验组与对照组P值<0.05，有统计学意义，提示：在肝、心、脑组织中有与排斥反应密切相关的细胞因子介导的炎性趋化反应和炎细胞的激活。（2）大鼠肾移植后肝、心、脑组织中MMP-2、TIMP-2的表达，实验组与对照组P值<0.05，有统计学意义，提示：由于MMPs/TIMPs表达时象及量效的不平衡会造成移植早期器官组织结构的破坏和移植后期ECM在细胞外堆积导致血管硬化狭窄、高血压发生和肝脏纤维化。（3）大鼠肾移植后肝、心、脑组织中Perforin、Granzyme、Fas、Fas-L、Tunel的表达，实验组与对照组P值<0.05，有统计学意义。提示：有细胞毒T淋巴细胞（CTL）经Fas/FasL通路和穿孔素/颗粒酶途径介导的细胞凋亡发生。细胞凋亡是移植排斥反应中移植物细胞死亡的主要方式，如果以引发T细胞凋亡为主，则会诱导移植免疫耐受产生。 应用原位杂交技术检测排斥反应相关因子mRNA的变化：大鼠肾移植后肝、心、脑组织中IL-2、IL-6、IFN-γmRNA探针的结果实验组与对照组P值<0.05，差异有统计学意义，进一步在转录水平验证了与排斥反应密切相关的细胞因子在移植肾大鼠中心、脑、肝组织表达，说明了心肾移植后心、脑、肝组织有排异反应引起的炎症反应和组织细胞凋亡的存在。 结论：（1）108例肾移植病例中，出现急性排斥反应患者的肝、心、脑组织合并症发生率较高。其中肝脏损害发生率（9/24）37.5 ％，心脏损害发生率（18/24）75 ％，脑损害发生率（4/24）16.6 ％。急性排斥反应与肝、心、脑损伤有相关性。(2)本实验证实，肾移植大鼠，急性排斥反应发生时受体的重要脏器肝、心、脑组织在一定时期内病理学改变不明显。(3)大鼠肾移植发生急性排斥反应时，受体大鼠的肝、心及脑组织在分子生物学水平发生了变化：大鼠肾移植后肝、心、脑组织中与排斥反应密切相关的IFN、IFN-γ、RANTES出现了高表达提示：当外来抗原进入受鼠后，抗原递呈细胞将外来器官的抗原递呈给T细胞，与T细胞受体相互作用产生一系列信号，激活T细胞的IFN、 IFN–R、RANTES基因，分泌相关排异因子，最终导致细胞活化，引发炎性反应。MMP-2、TIMP-2在移植肾大鼠肝、心、脑组织中的高表达则从另一方面提示：由于MMPs/TIMPs表达时象及量效的不平衡，会导致大鼠肾移植后早期肝、心、脑组织结构的破坏以及晚期ECM在细胞外堆积导致组织血管硬化狭窄、高血压发生和肝脏纤维化。排斥反应相关的凋亡因子Perforin、Granzyme B、Fas、Fasl在移植肾大鼠肝、心、脑组织中的高表达说明：由排斥反应导致的组织细胞凋亡不仅仅在移植器官发生，肾移植大鼠的心、脑、肝脏也有组织细胞凋亡基础的存在，这些细胞凋亡产生的结果最终使器官损伤或使器官免疫耐受尚待进一步说明。用原位杂交技术检测移植肾大鼠中IL-2mRNA、IL-6mRNA和IFN-γmRNA的高表达，进一步在转录水平验证了由于排斥反应引起的炎症反应和组织细胞凋亡的存在。基于上述因子在移植肾大鼠肝、心、脑组织中的表达，由此我们推断肾移植后其它脏器损伤的可能机理如下：①供体抗原自移植物脱落后，经血液流至全身其它脏器组织，停留在肝、心、脑组织中。②供体抗原与受体细胞的“微嵌合状态”的存在（1992年Starzl对长期存活的2例肝移植和5例肾移植受者皮肤、淋巴结、肾、骨髓等多种器官，采用PCR进行检查，均发现这些组织中有供者源性的细胞，称之为“微嵌合状态”。）③上述两种原因导致肝、心、脑组织中有异体抗原的存在，并为受者APC捕获、加工、处理，并递呈给T淋巴细胞，导致起激活并分泌IFN-γ、RANTES，它们进一步活化和趋化细胞毒T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞，产生大量Perforin、Granzyme B、Fas、Fasl等与排斥反应密切相关的细胞因子，协助它们发生细胞毒性组织损伤和组织细胞的凋亡，进而引起局部组织损伤。移植肾发生急性排斥反应后，短期内受体的肝脏、心脏、脑组织无临床可以检测的变化和在一定时期内组织病理学改变不明显，但在分子生物学水平发生了一定变化，这些变化可能在以后的多器官功能损害与免疫耐受方面起着一定的作用。本题在不同分子生物学水平验证了肾移植后肝脏、心脏和脑组织中也有急性排斥反应所引发的炎性损伤的潜在可能。但受体鼠组织中这些损伤性因子的变化未发展为组织病理水平的变化原因尚不明，可能与急性排斥发生的持续时间及强度有关或者此时尚处于炎性反应的早期，还待进一步证实。移植急性排斥反应发生后临床使用抗急性排斥反应药物及其他多种多器官保护性药物，加强了保护因素的作用，抑制了排斥反应相关因子的表达和其进一步发展成为损害作用的可能，这可能是移植后较少患者出现临床重要器官损害表现的原因。 Perforin、Granzyme B、Fas、Fasl的高表达，如同在异体肾移植中，也可能成为肝脏、心脏、脑组织早期排斥反应的监测指标。 本实验研究提示，为有效防治移植肾脏发生急性排斥反应及因排斥反应出现多器官损害并发症的发生，应该尽早对肝、心、脑等重要器官进行保护性治疗。