蒜氨酸原料药的中试生产工艺及分析方法研究

摘要

大蒜作为一种重要的药用植物，大量研究表明其具有预防心血管疾病和抗癌等方面的生物活性，中亚地区包括中国新疆是大蒜的原产地。蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜，alliin)是完整、未受损大蒜里面含量最丰富的硫化物，并且非常稳定，它存在于大蒜的细胞质里；当细胞受损时，蒜氨酸酶从细胞液向细胞质释放，蒜氨酸和蒜氨酸酶接触被迅速转化为一系列新的化合物—蒜辣素及其相似物，蒜辣素(双烯丙基硫代亚磺酸酯，allicin)被认为是大蒜中最重要的活性成分，但它相当不稳定，易于自身反应。按照课题的设计思路，蒜氨酸作为大蒜中最主要的原始活性成分及风味物质来源，将被单独提取纯化；同时提取收集大蒜多糖。为了完成蒜氨酸原料药的中试生产及原料药质量控制中复杂多组分分析，在前期研究工作的基础上，完成了如下工作： 首先建立了蒜氨酸和蒜辣素的准确方便的定量测定方法。首次采用非衍生化的HPLC-内标法对鲜蒜中蒜氨酸定量，在样品处理时从6种灭酶方法中确定微波加热方式使蒜酶灭活最为彻底。此法不仅较之前的衍生化法简单方便，也比非衍生化的外标法更为准确，同时验证并指出了美国药典测定蒜氨酸方法的失误；该法同样适于测定蒜氨酸原料药及制剂。另外建立了4-MP紫外法快速测定鲜蒜中蒜辣素的方法，具有快速、方便、价廉、灵敏度高等优点；与英国药典测定结果一致，该方法可以适应测定蒜氨酸含量和蒜酶活力，同时可方便应用于考察蒜酶动力学特性。从新疆各地鲜蒜50多个样品的品质调查发现，各地含量普遍较高，均高于USP 0.5％的标准；新疆地域广，生态多样，环境差异大，大蒜品质主要受生境、气候、土壤及水肥的影响较大，大蒜标准化种植势在必行。 第二，在进行蒜氨酸提取纯化实验室工艺考察中，确定微波加热方式蒜酶灭活彻底的时间；不同浓度乙醇提取蒜氨酸时，20％较好，不仅提取效率高同时利于提取溶液较长时间存放而不会腐败；通过正交设计筛选出恰当提取次数为超声提取3次，料液比为1:3；超滤澄清效果好，且无损失。阳离子交换树脂法分离纯化蒜氨酸时，从2种候选树脂中选定001×7型(732)树脂吸附量较大，适宜的上柱样品应为pH=2、浓度为适中的大蒜提取溶液，水洗多糖的量为6倍柱体积，氨水最佳解吸浓度为0.5mol/L，同时90％的大蒜多糖得以收集，鲜蒜中蒜氨酸的收率可大于50％。40℃时70％乙醇对蒜氨酸粗品结晶，蒜氨酸纯度可达90％以上。第三，小试工艺可行、稳定，原料、中间体和产品的质量控制方法已建立的情况下，我们采用与生产相符的条件进行工艺放大研究。在制定中试生产标准操作规程中，考察了隧道式干热烘干机杀酶的温度、时间和效率，干热灭酶效率只能达到70％，待改进；改良的筛板使带皮打浆效果良好，证明非脱皮熟蒜打浆的可行性，减少了工序，降低了成本：提取过程中，20％酒精分别1:3和1:2提取2次，效率达90％以上；硅藻土板框过滤时，探索了精滤过程中提取液中预涂和过滤时硅藻土的比例分别为3％和1％，并考察硅藻土对蒜氨酸的吸附损失，滤液澄明度良好，蒜氨酸损失很少：在树脂吸附分离阶段，采用三种简便灵敏检测手段控制生产过程，分离蒜氨酸的效果与实验室一致，酸性流分中蒜氨酸收率可达50％以上，干燥后蒜氨酸纯度达50％以上；试验发现浓缩蒜氨酸洗脱液时温度和浓缩时间对蒜氨酸损失的具有很大影响。最终蒜氨酸得率和质量达到了设计要求。 最后为了了解蒜氨酸原料药中的复杂物质组成；我们采用正相非衍生化和反相衍生化的HPLC-MS-MS对不同纯度的蒜氨酸原料药中的有关物质进行了系统研究，证实蒜氨酸原料药中不仅包含蒜氨酸的异构体异蒜氨酸和环蒜氨酸，蒜氨酸同系物甲基蒜氨酸以及蒜氨酸来源物质脱氧蒜氨酸以外，还含有精氨酸、胱氨酸、天门冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺等其它氨基酸成分。质谱总离子流TIC图与其UV图相比可以更加灵敏的反映复杂组分，但对个别组分例外。5种其它氨基酸在正反两色谱系统中均被检测，但环蒜氨酸和脱氧蒜氨酸在衍生化后的反相系统中未能被检测。由蒜氨酸精制品和蒜氨酸中试品的质谱图可以看出，随着蒜氨酸纯度的增加，杂质的种类和含量明显减少。这些研究结果为制定蒜氨酸质量标准和申报新药打下了良好的基础。

目录

论文说明：中英文缩略词对照表

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摘要

前言

第一部分 蒜氨酸和蒜辣素分析方法的建立

第一章 蒜氨酸分析方法的建立

1.仪器与试剂

2.实验方法

3.结果

4.不同产地鲜蒜及大蒜制品中蒜氨酸含量调查

5.小结与讨论

第二章 蒜辣素分析方法的建立

1.仪器与试剂

2.方法与结果

3.与BP的HPLC内标法测定蒜辣素方法进行比较

4.讨论

第二部分 提取纯化鲜蒜中蒜氨酸的实验研究

第一章 鲜蒜中蒜氨酸的提取工艺研究

1.主要仪器与试药

2.方法及结果

3.小结

第二章 离子交换树脂分离纯化鲜蒜中蒜氨酸

1.实验材料

2.实验方法

3.工艺条件的考察

4.工艺条件的确定及分析

5.结论

6.讨论

7.小结

第三部分 蒜氨酸原料药的中试生产工艺研究

1.生产材料和设备

1.1材料

1.2设备

2.生产方法

2.1制备工艺流程(见图3-1)

2.2物料生产车间布局图

2.3蒜氨酸中试生产标准操作规程

2.4蒜氨酸中试工艺控制和质量控制点

3.中试生产结果与讨论

3.1灭酶

3.2破壁打浆

3.3两次稀醇提取、离心

3.4离心液精滤

3.5精滤液浓缩

3.6浓缩液的精滤

3.7阳离子交换树脂分离纯化蒜氨酸

3.8酸性洗脱液脱色、浓缩、干燥

3.9大蒜多糖的收集

4.小结

第四部分 蒜氨酸原料药中有关物质的研究

第一章 NP-HPLC-MS-MS色谱检定蒜氨酸原料药中有关物质

1.实验材料

2.方法

3.实验结果

4.小结与讨论

第二章 RP-HPLC-MS-MS色谱检定蒜氨酸原料药中有关物质

1.仪器与试药

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

致谢

参考文献

综述:蒜氨酸及其系列活性组分的研究进展

攻读博士学位期间发表的学术论文

个人简历

新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表