核黄素及其转运基因变异与新疆哈萨克族食管鳞状细胞癌发病相关性研究

摘要

目的：新疆是我国食管癌的集中高发区，其中以哈萨克族食管癌发病率最高，维吾尔族、汉族次之。核黄素缺乏是目前已知的食管癌主要危险因素，研究表明膳食补充核黄素能显著降低食管癌发病风险，但膳食补充核黄素干预效果存在个体差异。提示环境和遗传因素在食管癌发生中存在交互作用。我们在前期 GWAS研究中发现：核黄素转运基因（C20orf54）是食管癌易感基因，其主要功能为促进核黄素转运及吸收利用，现有研究仅认识了该基因可能是食管癌环境与遗传因素交互作用的关键靶点，但对于其导致核黄素利用率下降及核黄素干预实验差异机制尚不明确。为深入了解C20orf54对核黄素调控机制，本项目拟采用Mass ARRAY，PCR-RFLP及免疫组化等方法，从基因转录（mRNA）、蛋白表达及基因组表观遗传学修饰（启动子甲基化）水平等三种基因表达调控层次分析食管癌发生与C20orf54表达调控关系。以此进一步认识环境与遗传因素在食管癌发病和种族差异中交互作用分子机制，为食管癌的高危人群筛查和个体化预防的特异性新靶点提供实验依据。
　　方法：1）收集新疆哈萨克族、维吾尔族和汉族食管癌患者癌组织及癌旁正常组织标本，制备组织切片，选择 C20orf54特异性单克隆抗体，利用免疫组织化学方法，分析 C20orf54的蛋白质表达水平与食管癌进程的相互关系。提取新鲜食管病变组织总 RNA，经合成 cDNA，设计和合成 C20orf54特异性引物，应用定量RT-PCR方法检测该基因mRNA表达水平，确定其对食管癌进程的标记作用及临床应用价值；2）高效液相色谱法（HPLC）测定以上食管病变患者外周血液中核黄素水平，同时开展“以人群为基础的病例对照研究”，随即选取与食管癌患者所在地区相对应的正常人群，分析不同民族食管癌患者与健康对照人群血液中核黄素水平的差异，并分析同一患者核黄素转运基因 C20orf54蛋白表达与血液核黄素水平的关系；3）从 Genbank数据库获取基因信息，利用专业软件扫描基因启动子区，设计出CpG岛片段特异性引物，对亚硫酸氢盐修饰的食管癌细胞DNA进行PCR扩增、载体克隆和测序分析，获得基因甲基化相关的序列和CpG位点信息。依托 Sequenom MassARRAY技术，选择确认的CpG岛片段及其特异性引物，对食管病变组织DNA进行CpG岛片段甲基化水平定量分析，确定不同组织甲基化片段及其CpG位点之差异以及不同民族食管癌组织C20orf54基因甲基化状态差异。
　　结果：1）通过对 C20orf54蛋白表达免疫组化分析，发现在哈萨克族食管癌组织中 C20orf54蛋白缺失表达率为42.6％，显著高于癌旁正常组织13.1%，C20orf54蛋白在食管癌组织较癌旁正常组织呈显著低表达状态。随着肿瘤分化程度上升，食管癌组织内C20orf54蛋白质表达水平呈现由正常强表达、中度表达到弱表达和或表达缺失的转变，而在淋巴结转移、侵润深度两项临床病理参数食管癌组织与癌旁组织无差异。RT-PCR结果表明C20orf54基因mRNA在食管癌组织中表达降低、而在正常食管组织中表达上调。其表达下调趋势与蛋白表达相一致；2）通过使用高效液相色谱法对食管癌患者及正常对照组外周血核黄素水平检测发现，哈萨克族食管癌患者组外周血核黄素水平（2.6468±1.3474 ng/ml）显著低于正常对照组（4.2960±3.2293 ng/ml），差异具有统计学意义（P=0.015）。不同分化程度患者外周血核黄素水平分析发现与蛋白表达相一致，高分化食管鳞状细胞癌患者体内核黄素水平较中分化及低分化癌患者明显升高。哈萨克族食管癌患者外周血核黄素水平与核黄素转运基因蛋白表达呈正相关（F=8.626P＜0.05）；3）根据Sequenom MassARRAY DNA甲基化测试和数据分析，C20orf54基因在食管癌组织总甲基化水平高于癌旁正常组织，两者比较具有统计学意义（P＜0.05）。单点甲基化率分析显示，在C20orf54基因12CpG位点中，5个CpG位点（CpG_2，CpG_3，CpG_4，CpG_7，CpG_10）在食管癌组织及癌旁正常组织之间具有“单点”差异，其差异均有统计学意义（P＜0.05）。比较分析以上基因的目的片段甲基化水平变化与“第一部分”所述的蛋白质水平表达改变，可以看出C20orf54基因的甲基化水平变化与蛋白质表达变化（阳性）呈负相关。
　　结论：1）核黄素转运基因C20orf54的转录表达下调或蛋白质表达缺失与哈萨克族食管癌病变进程密切相关，可以成为建立肿瘤分子标志物体系重要候选基因；2）食管癌患者体内核黄素水平显著低于正常人群，而不同分化程度肿瘤比较发现随着肿瘤恶性程度上升，食管癌患者体内核黄素水平下降。提示核黄素与哈萨克族食管癌发生及病理演变密切相关；3）哈萨克族食管癌患者C20orf54基因的启动子区甲基化水平显著高于正常组织，而其甲基化与蛋白表达呈负相关，即异常甲基化可能是蛋白表达下调继而影响核黄素代谢的重要分子机制。

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前言

第一部分食管癌及癌旁正常组织C20orf54蛋白及mRNA表达水平研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分食管癌患者及正常人群体内核黄素水平差异研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分核黄素转运基因C20orf54基因启动子甲基化状态食管癌发病相关性研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

致谢

参考文献

综述

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表