乌鲁木齐县2-14岁人群HBV病毒株变异及OBI生物标志物研究

摘要

目的:探讨中、小学生(7-14岁)及学龄前儿童（2-6岁）乙型肝炎病毒隐匿性感染(occult hepatitis B virus infection OBI)后S基因片段变异位点与OBI发生的关系;4种miRNA表达谱与OBI发生的关联性;初步探讨miRNA用于早期诊断OBI的可行性。
　　方法:用整群抽样方法选择乌鲁木齐县4所中、小学综合性学校，对在校的学生采用酶联免疫试剂法(ELISA)和化学发光法进行乙肝HBsAg、抗-HBs两项血清学指标进行检测，对检测发现的HBsAg和抗-HBs2项指标均为阴性的469名中、小学生的一份血清用QIAGEN公司的试剂盒提取HBV-DNA产物，利用聚合酶链反应(PCR)扩增HBV-DNA S基因片段，对43份有目的条带的PCR扩增产物进行HBV基因S区(544bp)序列测定。测序后建立HBV序列数据库，并用MEGA5软件将测序结果与NCBI国际核苷酸序列数据库协作组（INSDC，原Genbank）收录的序列进行对比分析，以获得HBV基因S区序列的核苷酸变异规律;基于S区基因片段的进化模型选择，测定序列与INSDC收录的参考序列建立进化树，确定病毒的基因型，比较其基因型分布的差别，分析产生变异的核苷酸位点。40例序列测定成功的中、小学生按汉族，少数民族（包括汉族、哈族和回族）1∶1匹配，符合匹配条件的有20名学生，这20名学生作为OBI研究对象。在整群抽样调查后，随机选取与OBI组年龄、性别和族别相匹配的20名健康学生和20名HBsAg阳性学生作为对照。共计60份血清用QIAGEN公司的试剂盒提取RNA，转录为cDNA，继而进行荧光定量PCR测定4种miRNA的相对表达量。用同样的方法选择4所幼儿园，对在园的学龄前儿童采用ELISA进行HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc5项检测，对259例HBsAg阴性血清用Promega公司的试剂盒提取HBV-DNA产物，进行PCR扩增HBV-DNA S基因片段，对发现的21份目的条带进行测序。用上述方法获得核苷酸变异规律，确定基因型。
　　结果:469份中、小学生血样标本中用PCR扩增共发现43份HBV DNA刚性标本。其中，40份测序成功，32例B基因型样本均为adw2血清型，6例C基因型样本5例为adrq+血清型，1例为ayw2血清型。2例D基因型样本均为ayw2血清型。D基因型仅在哈萨克族学生中出现。S基因序列翻译成对应的氨基酸后分别发生I110L、S113T、K122R、T126I、F134Y、T143S、K159G和K160R突变。S基因MHR区氨基酸变异在性别、民族中的差异均无统计学意义。4种miRNA在健康对照者与HBV感染者和健康对照者与OBI感染者血清中的表达，let-7c，miR-122和miR-150的差异有统计学意义，但miR-23b在血清中的差异无统计学意义。另外，OBI感染者中，let-7c，miR-23b，miR-122和miR-150在汉族和少数民族血清中的差异没有统计学意义。OBI感染者的血清miRNA表达与S基因MHR区氨基酸变异次数的相关关系均为负相关。let-7c，miR-122，miR-150和miR-23b与基因序列MHR区变异的突变次数的相关系数分别为-0.606，-0.902，-0.955和-0.897;P值分别为0.202，0.009，0.003和0.015.miR-122，miR-150，let-7c与S基因MHR区氨基酸变异次数显著相关。在血清中表达有差异的3种miRNA区分OBI感染者和正常对照时，曲线下面积(Area under curve，AUC)为96.4％(灵敏性:92.6％，特异性:90.8％)。用受试者工作特征(ROC)曲线评价各miRNA时，体现出了一定的诊断价值。259份学龄前儿童血样共发现21份HBV DNA阳性标本，均测序成功。其中1例由于存在氨基酸插入，没有检测出具体基因型。其余20例样本均为C基因型，其血清型均为adrq+亚型。S基因序列翻译成氨基酸后分别发生I110L、S123T、T124S、T126I、T131N、F134Y和P142H突变。126位点和134位点氨基酸的变异在中、小学生与学龄前儿童的差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:中、小学生及学龄前儿童隐匿性乙型肝炎病毒感染后S基因氨基酸存在不同频率的变异情况。miRNA的表达量与S基因MHR区氨基酸变异的突变次数呈现出一定的相关性。3种miRNA的表达量与OBI有关，体现出了一定的诊断价值。

目录

声明

中英文缩略词对照表

摘要

前言

研究内容与方法

1 研究对象

1．1 抽样对象

1．2 中、小学生中OBI研究对象

1．3 miRNA研究对象

1．4 学龄前儿童OBI研究对象

2 相关仪器与试剂

2．1 巢式PCR扩增体系

2．2 反转录体系制备

2．3 荧光定量PCR反应体系制备

2．4 荧光定量PCR循环条件

2．5 血清miRNA表达与基因序列变异位点的关联性研究变量赋值方法

3 实验方法

4 数据处理

5 质量控制

结果

讨论

小结

致谢

参考文献

综述 OBI诊断生物标志物及病毒株变异研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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