棘球蚴囊液蛋白质组学及主要分泌蛋白对宿主免疫调节的影响

摘要

目的:棘球蚴病，又称为包虫病，是由棘球绦虫幼虫寄生于人体及绵羊等中间宿主体内所致的一种严重的人畜共患寄生虫病，呈世界性分布。在我国人体包虫病主要有两种类型，即由细粒棘球绦虫（E.g）引起的囊型包虫病(CE)和由多房棘球绦虫（E.m）引起的泡型包虫病(AE)。两型包虫病危害严重，防治研究刻不容缓。本研究旨在:(1)建立稳定的E.g和E.m体外成囊培养平台，为研究特定因素对棘球蚴生长发育的影响以及抗棘球蚴药物的筛选等研究提供实验材料。(2)通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)蛋白质组学分析方法，对体外成囊培养获得的E.g和E.m囊液进行蛋白质组深度测序，确定包囊囊液中分泌蛋白表达谱，筛选对宿主免疫系统具有调节作用的分泌蛋白。(3)明确棘球蚴感染及棘球蚴关键分泌蛋白抗氧化蛋白EgTPx对宿主巨噬细胞极化方式的调节，探讨棘球蚴感染早期的免疫逃避机制。(4)研究E.g感染减轻或抑制过敏性哮喘气道炎症的作用机制，为利用寄生虫分泌蛋白开辟新的过敏性哮喘或其他自身免疫性疾病的防治策略提供重要依据。
　　方法:
　　(1)分别从屠宰场自然感染E.g的绵羊肝脏及实验室E.m保种的灰仓鼠中采集新鲜原头蚴(PSC)，经1％的胃蛋白酶消化后检测虫体活性并计数，于37℃、5％ CO2条件下进行体外培养，在培养的不同时间点随机取样于倒置显微镜下观察、拍照，记录PSC的生长发育情况，通过透射电子显微镜观察培养囊泡的超微结构;将体外培养获得的E.g和E.m微囊以每鼠50个微囊的剂量，通过腹腔注射的方法分别接种BALB/c小鼠，并对接种感染获得的包虫囊进行计数和HE染色，计算感染率和成囊率。
　　(2)分别收集来自体外培养的E.g和E.m囊泡中的囊液，经真空冷冻干燥、定量、酶解和SCX分离后，采用基于Triple TOF5600的LC-MS/MS分析系统和蛋白数据库（Eg_proteins.fa和Em_proteins.fa以及牛血清库uniprot_Bovine_serum.fa）对囊液进行蛋白表达谱的鉴定和生物信息学分析，使用SignaIP，TMHMM，Targetp等软件对鉴定到的蛋白进行经典及非经典分泌蛋白的预测分析。
　　(3)体外培养PSC，利用RNAi技术沉默EgTPx基因的表达，确定EgTPx对E.g抵抗氧化损伤的重要作用;通过RT-PCR方法克隆EgTPx基因，利用点突变的方法构建其突变体，大肠杆菌原核表达系统表达重组EgTPx及其突变体蛋白，通过保护DNA超螺旋（MCO系统）等实验鉴定其生物学功能;采用贴壁法分离纯化感染E.g和E.m小鼠的腹腔巨噬细胞，使用巨噬细胞的特异性引物(iNOS、Ym1、Fizz1、Arginase1)鉴定巨噬细胞极化类型;通过M-CSF体外诱导培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞，分别添加LPS、IL-4、囊液抗原、重组蛋白EgTPx及其突变体蛋白进行刺激，收集细胞，提取RNA，使用巨噬细胞的特异性引物进行PCR扩增，鉴定巨噬细胞极化类型。
　　(4)采用卵清白蛋白(OVA)致敏和激发，建立E.g感染合并过敏性哮喘小鼠模型，通过小鼠无创肺功能检测仪检测小鼠气道高反应;HE及PAS染色观察肺组织病理变化及炎症细胞浸润程度;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹以及流式细胞仪检测肺组织、血液、脾脏中Th1/Th2/Th17/Treg相关细胞因子的表达变化，探讨E.g感染是否对过敏性哮喘气道炎症具有减轻或抑制作用，分析其可能的作用机制。
　　结果:
　　(1) E.g和E.m原头蚴在体外培养15d时微囊逐渐形成，60d时包囊外围形成透明角质层结构，100d后形成肉眼可见的囊泡;超微结构显示E.g囊泡外部有较厚的无细胞薄片层，而E.m囊泡薄片层较薄，生发层细胞较为丰富，并可见生发囊及囊内PSC产生。采用体外培养的E.g和E.m微囊经腹腔接种小鼠，感染率均为100％，E.g包虫囊为游离单囊，成囊率达70％，囊内无PSC产生;Em包虫囊为似肿瘤状的团块状组织，有生发囊及PSC产生。
　　(2) SDS-PAGE显示E.g和E.m囊液蛋白主要集中在1-100 kDa之间，采用LC-MS/MS分别鉴定得到774个E.g蛋白，2305个E.m蛋白。其中，E.g经典型分泌蛋白有52个，E.m有122个，主要包括抗原B的不同亚型。经GO功能注释发现E.g和E.m囊液蛋白所参与的生物过程主要为:细胞加工处理(cellular process)，代谢过程(metabolic process)，生物调节(biological regulation)和应激反应(response to stimulus)等;所参与的分子功能主要为:结合(binding)和催化活性(catalytic activity)等;在细胞组分中，绝大多数的蛋白质都归为细胞(cell)和细胞部分(cell part)。经COG信息注释发现E.g和E.m囊液蛋白均含有23个功能分类，主要为仅预测一般功能、分子伴侣及碳水化合物的转运和代谢等。经KEGG通路分析表明，囊液中的蛋白参与完整的糖酵解途径，说明在囊液中能够完成糖类的分解代谢，可直接为虫体的生长发育提供营养和能量。
　　(3)通过观察PSC的活性状态，确定体外自然条件下PSC耐受H2O2的最大浓度为0.6mM;利用RNAi技术沉默EgTPx基因表达，筛选出有效干扰序列为TPx siRNA-3;成功克隆、表达EgTPx基因及其3个突变体， MCO系统鉴定重组EgTPx具有抗氧化的生物学特性;棘球蚴感染、重组EgTPx及其突变体蛋白均可替代性激活巨噬细胞向M2型分化。
　　(4)E.g感染可抑制OVA诱导的小鼠气道高反应;HE和PAS染色显示E.g感染可减轻OVA诱导的小鼠肺终末支气管周围的炎性细胞浸润及粘液分泌;E.g感染后Treg细胞相关细胞因子IL-10水平显著升高，Th17细胞相关细胞因子IL-17A水平显著降低，推测E.g感染可通过上调IL-10的表达，下调IL-17A的表达，导致Treg/Th17的失衡，从而抑制哮喘的气道炎症反应。
　　结论:
　　(1)建立了稳定的E.g和E.m体外成囊培养平台，可剔除宿主因素的干扰，研究特定因素对虫体生长与发育的影响，为后续囊液蛋白质组学研究提供充足的实验材料。
　　(2)建立了微囊法小鼠E.g和E.m继发感染模型，感染率为100％，为疫苗研制、药物筛选和疗效判定提供研究动物模型。
　　(3)首次对体外培养获得的棘球蚴囊液进行了蛋白质组学深度测序，明确了囊液中分泌蛋白表达谱，鉴定到一些高表达的分泌蛋白，它们与虫体自身的能量代谢、抵抗氧化损伤及宿主间交互作用呈密切相关，对于维持虫体正常的生命活动具有重要意义。
　　(4)利用RNAi技术可有效沉默细粒棘球蚴EgTPx基因的表达，明确其对细粒棘球蚴抵抗氧化损伤，维持正常生长存活十分必要，研究结果将为棘球绦虫及其他寄生虫基因功能的研究提供技术参考。
　　(5)克隆、构建并表达出EgTPx蛋白及其3个突变体，明确棘球蚴感染和抗氧化蛋白EgTPx可诱导巨噬细胞向M2型极化，释放抗炎因子，对于抑制Th1型炎症反应和促进Th2型免疫应答，维持在宿主体内的寄生至关重要。
　　(6)利用E.g感染合并过敏性哮喘小鼠模型，发现E.g感染可减轻或抑制过敏性哮喘的气道炎症反应。E.g感染引起Treg细胞相关细胞因子IL-10水平升高，Th17细胞相关细胞因子IL-17A水平降低，导致Treg/Th17的失衡，从而抑制哮喘的气道炎症反应，为利用寄生虫分泌蛋白开辟新的过敏性哮喘或其他自身免疫性疾病的防治策略提供重要依据。

目录

声明

中英文缩略词对照表

摘要

前言

第一部分 棘球蚴体外成囊培养及微囊法棘球蚴继发感染小鼠模型的建立

1 研究材料与方法

1．1 研究材料

1．2 研究方法

2 结果

2．1 棘球蚴体外成囊培养观察

2．2 微囊法建立小鼠棘球蚴继发感染模型

3 讨论

4 小结

第二部分 棘球蚴囊液蛋白质组学研究

1 研究材料与方法

1．1 研究材料

1．2 研究方法

2 结果

2．1 棘球蚴囊液蛋白SDS-PAGE及定量结果

2．2 棘球蚴囊液蛋白Label-free定量分析的准确性评价

2．3 棘球蚴囊液蛋白质组的总体分析

2．4 棘球蚴囊液蛋白的GO功能注释及富集分析

2．5 棘球蚴囊液蛋白的COG功能注释分析

2．6 KEGG信号通路分析

2．7 棘球蚴囊液蛋白经典／非经典分泌蛋白的预测分析

2．8 棘球蚴囊液中Top50蛋白的分析

2．9 棘球蚴囊液中牛血清相关蛋白分析

3 讨论

4 小结

第三部分 棘球蚴感染及其关键分泌蛋白EgTPx对宿主巨噬细胞极化方式的免疫调节

1 研究材料与方法

1．1 研究材料

1．2 实验方法

1．3 数据处理及统计学分析

2 结果

2．1 PSC耐受H2O2的浓度确定

2．2 EgTPx对细粒棘球蚴生长存活的影响

2．3 EgTPx基因的克隆及其突变体的构建和表达

2．4 重组蛋白EgTPx及其突变体蛋白的抗氧化物酶活性测定

2．5 棘球蚴感染诱导小鼠腹腔巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化

2．6 小鼠骨髓来源巨噬细胞的形态观察和流式检测

2．7 重组蛋白EgTPx及其突变体蛋白对小鼠骨髓来源巨噬细胞激活方式的调节

3 讨论

4 小结

第四部分 细粒棘球蚴感染对小鼠过敏性哮喘气道炎症反应抑制的机制研究

1 研究材料与方法

1．1 研究材料

1．2 研究方法

2 结果

2．1 细粒棘球蚴小鼠感染模型的建立

2．2 细粒棘球蚴感染抑制OVA诱导的小鼠气道高反应(AHR)

2．3 肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞的检测

2．4 肺组织的病理学检测

2．5 肺组织中细胞因子的检测

2．6 小鼠脾脏中Treg细胞和Th17细胞含量的检测

2．7 血清和脾脏淋巴细胞培养上清中细胞因子检测

2．8 血清中免疫球蛋白亚型的检测

3 讨论

4 小结

致谢

参考文献

综述 棘球绦虫及其蛋白质组学研究进展

附录

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表