基于分子技术伊贝母及同属新疆贝母ISSR遗传多样性研究

摘要

目的:通过ISSR分子标记技术对新疆不同产区伊贝母种质资源及新疆贝母属药用贝母进行遗传多样性分析及评价，为其品种保护、资源利用、品种分类提供理论依据。
　　方法:
　　1）采用3种不同的提取方法提取贝母属药用贝母的总DNA，比较得到最适于贝母属药用贝母的提取方法。
　　2）综合利用单因素实验和L16(45)正交试验，对新疆贝母属药用贝母ISSR-PCR反应体系影响因素TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物浓度、模板DNA含量进行优化。
　　3）采用优选出的试剂盒法及优化的ISSR-PCR反应体系对16个居群128份伊贝母分别进行DNA提取及ISSR-PCR扩增，同时对伊贝母种质资源进行遗传多样性分析。
　　4）采用优选出的试剂盒法及优化的ISSR-PCR反应体系对新疆贝母属8种药用贝母23份样品进行DNA提取及ISSR-PCR扩增，并对其样品进行遗传多样性分析。
　　结果:
　　1）3种方法均可提取出产量较高的基因组DNA，但试剂盒法相较提取的总DNA纯度最高，质量最好，并且均能扩增出丰富清晰的条带，稳定性高，操作简单耗时短。
　　2）每个因素的不同水平对PCR反应有显著影响，其中Mg2+影响最大。确立新疆贝母属药用贝母ISSR-PCR最优体系为50μL:5μL10×Buffer、2.5 mmol/L Mg2+、0.30 mmol/L dNTPs、0.8μmol/L引物、0.75 U Taq酶、1.0 ng/μL模板DNA、33.35μL ddH2O。
　　3）不同产地伊贝母种质资源遗传多样性:从74条引物中筛出15条条带清晰、多态性好的引物，共扩增出239条条带，其中227条具多态性，占94.98％。伊贝母居群遗传多样性水平:Na=1.9498，Ne=1.3426, H=0.2190, I=0.3503,Ht=0.2227±0.0266,Hs=0.1046±0.0055,Gst=0.5304,Nm*=0.4427，遗传一致度(I)为0.7344～0.9666，遗传距离(D)为0.0340～0.3088。聚类结果显示，所有新疆贝母和伊犁贝母均可区分开，遗传相似系数介于0.69～0.95，并构建伊贝母ISSR分子标记指纹图谱。
　　4）新疆贝母属8种药用贝母遗传多样性:74条引物中筛选出16条多态性高、重复性好，扩增条带清晰的引物，共扩增出199条条带，其中多态性条带195条，占97.99％。8种药用贝母遗传多样性水平为:Na=1.9799,Ne=1.5230,H=0.3084,I=0.4669,Gst=0.6985,Nm*=0.2159，遗传一致度(I)和遗传距离(D)分别为0.7474和0.3014。聚类结果显示，所有贝母均可明显区分开来，并聚为4组，遗传相似系数范围在0.58～0.99。编制了ISSR分子标记检索表。
　　结论:
　　1）试剂盒法为贝母属药用贝母总DNA提取的最佳方法，其所得样品适用于新疆贝母属药用贝母及药典收录的其余药用贝母PCR及其他分子生物学研究。
　　2）建立的新疆贝母属药用贝母ISSR-PCR反应体系经23份新疆贝母属8种药用贝母样品检验，ISSR-PCR扩增效果显著，证明该体系具有较高的稳定性及可重现性。
　　3）不同产地伊贝母种植资源整体上有较高的遗传多样性，遗传变异存在于居群间，居群间的基因交流程度比较有限。
　　4）构建的伊贝母ISSR分子标记指纹图谱为伊贝母基源鉴别提供重要理论依据。
　　5）新疆贝母属8种药用贝母整体上有较高的遗传多样性，遗传变异主要存在于不同种间，基因交流程度比较有限。编制的ISSR分子标记检索表对新疆贝母属8种药用贝母品种的分类具有重要意义。
　　6）揭示了伊贝母种质资源及新疆贝母属药用贝母的遗传多样性水平，为其种质资源、品种分类、种质保护以及资源的综合评价利用提供理论依据。

目录

声明

中英文缩略语对照表

摘要

前言

研究内容与方法

1．材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验仪器与试剂

2 内容与方法

2．1 贝母属药用贝母总DNA提取方法的比较研究

2．2 新疆贝母属药用贝母ISSR-PCR体系的确立和优化

2．3 新疆不同产区伊贝母种质资源ISSR遗传多样性分析

2．4 新疆贝母属8种药用贝母遗传多样性ISSR分析

结果

1．贝母属药用贝母基因组DNA提取比较

1．1 贝母属药用贝母基因组DNA提取与检测

1．2 不同方法对贝母属药用贝母总DNA提取的综合比较

2．药用贝母ISSR-PCR体系的确立和优化

2．1 ISSR-PCR反应体系单因素试验

2．2 ISSR-PCR正交设计直观分析与方差分析

2．3 ISSR-PCR优化体系的稳定性检测

3．不同产区伊贝母种质资源ISSR遗传多样性分析

3．1 ISSR扩增结果

3．2 伊贝母植物居群间的遗传多样性

3．3 伊贝母不同居群的遗传分化

3．4 伊贝母植物的聚类分析和亲缘关系

3．5 伊贝母ISSR分子标记指纹图谱的构建

4．新疆贝母属8种药用贝母遗传多样性分析

4．1 ISSR扩增结果多态性分析

4．2 新疆贝母属药用贝母ISSR分子标记检索表

4．3 新疆贝母属药用贝母遗传多样性分析

4．4 新疆贝母属药用贝母的遗传分化

4．5 8种药用贝母聚类分析及亲缘关系

讨论

小结

致谢

参考文献

附录

综述 贝母属药用植物遗传多样性研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

导师评阅表