H2-eb1基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定和H2-eb1基因在变应性鼻炎中功能的实验研究

摘要

目的：探讨变态反应性疾病中应用H2-eb1基因(人类同源基因称:HLA-DRB1基因)敲除小鼠的饲养、繁殖及基因型鉴定的方法，以及Th1、Th2细胞分泌的细胞因子（IL-4，IFN-γ和IgE）在H2-eb1基因敲除纯合小鼠、野生型变应性鼻炎小鼠和正常组小鼠鼻黏膜中的表达差异。
　　方法：本课题组在国家自然科学基金课题（基金号：81160125）的支持下与上海南方模式生物科技发展有限公司合作按照遗传学规则对129/SV种系小鼠进行基因型进行鉴定，应PCR Southern-bloting对提取的DNA进行测序和筛选，确定实验小鼠。采用Cre/Lo xP系统与ES细胞基因剔除技术结合进行目的基因剔除，构建基因剔除小鼠模型（应用常规基因剔除方法）。结果获得H2-eb1基因敲除杂合子小鼠，按照遗传学规则对杂合子（H2-eb1+/-）小鼠进行配对繁殖，用聚合酶链反应（PCR）（提取幼鼠尾部DNA）、蛋白免疫印迹（Southern-bloting）（肺、胸腺、鼻黏膜组织蛋白）的方法对幼鼠进行基因型鉴定。按鉴定结果随机选取8周雌性野生型（H2-eb1+/+）两组各12只、（H2-eb1-/-）纯合子型12只，取野生型（H2-eb1+/+）和（H2-eb1-/-）纯合子型各一组为实验组，野生型（H2-eb1+/+）一组为对照组，实验组采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏激发，建立小鼠变应性鼻炎模型。建模成功后取血分离血清与建模前血清，ELISA法检测白细胞介素（interleukin IL）4和IFN-γ（Interferon gamma）细胞因子水平和OVA特异性IgE抗体浓度。
　　结果：H2-eb1纯合子型（H2-eb1+/-）小鼠的繁殖和饲养均获得成功,采用PCR成功地对所获得的小鼠进行基因分析在子代小鼠中存在野生纯合子型（H2-eb1+/+）、杂合子型（H2-eb1+/-）及（H2-eb1-/-）纯合子型，3种基因型小鼠存活率无明显差异，出生后10天、30天质量无明显差异。成功建立变应性鼻炎模型之后，实验组与对照组相比血清中OVA-IgE、IL-4浓度明显升高，IFN-γ浓度明显降低（P<0.05）；而实验组中基因敲除纯合子造模组OVA-IgE、IL-4浓度明显低于基因敲除野生型造模组，基因敲除纯合子造模组 IFN-γ浓度明显低于基因敲除野生型造模（P<0.05）。
　　结论：本研究应用Cre/Lo xP系统与ES细胞基因剔除技术成功构建了变态反应性疾病敲除H2-eb1基因纯合子小鼠，为进一步研究确的饲养繁殖以及鉴定方法可从（H2-eb1-/-）杂合子型（因实验需同窝野生型和纯合子型小鼠，因此选用杂合子小鼠作为种鼠繁殖鉴定）或（H2-eb1-/-）纯合子型小鼠中都可获得（H2-eb1-/-）纯合子型小鼠。在变应性鼻炎中OVA-IgE、IL-4表达升高而IFN-γ降低，但敲除H2-eb1基因之后的纯合子造模组的OVA-IgE、IL-4表达升高程度明显低于野生型造模组，而野生型造模组IFN-γ降低程度纯明显低于合子造模组，提示H2-eb1基因在变应性鼻炎的发病机制中的Th1/Th2失衡有重要调节作用。

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前言

研究内容与方法

1 研究对象与材料

1.1 实验动物

1.2 实验器材和试剂

2 研究方法

2.1 H2-eb1基因敲除小鼠饲养繁殖

2.2 H2-eb1基因敲除小鼠变应性鼻炎模型的构建、评估

2.3 行为学观察[21]

2.4 动物的处死及标本处理及实验步骤

3 质量控制

4 技术路线图

5 统计学处理

结果

1 H2-e b1基因敲除小鼠基因型鉴定结果

1.1 PCR结果

1.2 鼻腔呼吸区黏膜、肺、胸腺蛋白表达

1.3 H2-eb1基因敲除小鼠各基因型小鼠的繁殖情况

1 . 4 敲除H2-eb1基因之后对小鼠生长情况的影响

1.5 3种基因型小鼠的生存率分析

1.6 基因敲除小鼠建模后的行为学观察

2.鼻黏膜病理组织学结果

2.1鼻黏膜HE染色结果

2.2小鼠血清OVAOVA特异性IgE、IL-4、IFN-γ检测

讨论

1 H2-e b1基因敲除小鼠饲养繁殖及鉴定

2 H2-e b1基因敲除小鼠变应性鼻炎模型的构建

小结

致谢

参考文献

综述: 基因敲除小鼠在医学研究中的应用

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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