Wnt/β-catenin信号通路在亚砷酸钠致HELF细胞损伤中的作用

摘要

目的：探讨Wnt/β-catenin信号通路在亚砷酸钠（NaAsO2）致人胚肺成纤维细胞（Human embryonic lung fibroblast，HELF）损伤中的作用，为阐述砷致肺损伤的分子机制提供研究依据。
　　方法：1．MTT法测定NaAsO2染毒HELF细胞的LC50，确定染毒浓度及细胞抑制率。2．荧光显微镜和电镜拍摄细胞结构变化。3．NaAsO2染毒后，硫代巴妥酸法（TBA）测定MDA含量、二硫代二硝基苯甲酸比色法测定GSH-PX活性、黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。4．β-catenin siRNA转染30.00μmol/L的NaAsO2处理过的HELF细胞。5．7-ADD联合Annexin V检测NaAsO2染毒及?-catenin siRNA转染后凋亡情况。6．实时荧光定量聚合酶链反应法（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测 NaAsO2染毒后β-catenin、C-myc、CyclinDl、Axin、Wnt5a及β-catenin siRNA转染后β-catenin、Wnt5amRNA表达。7．蛋白免疫印迹法（Western Blot）分别检测染毒后和转染后 HELF细胞中β-catenin、C-myc、CyclinDl、Axin、Wnt5a蛋白表达。
　　结果：1．NaAsO2致HELF细胞24h的LC50为135.04μmol/L。对照组NaAsO2浓度0.00μmol/L，低、中、高实验组NaAsO2浓度为10.00、20.00、30.00μmol/L。2．NaAsO2致HELF细胞线粒体肿胀、内质网扩张等微结构损伤。3．HELF细胞抑制率与NaAsO2浓度呈正相关（r=0.93，P<0.05）。4．SOD和GSH-PX活性随NaAsO2染毒浓度和染毒时间增加而降低（P<0.05），MDA含量随染毒浓度和染毒时间增加而升高（P<0.05）。5．HELF细胞早期凋亡率随染毒时间和染毒浓度增加而升高（P<0.05）。6．β-catenin、C-myc、CyclinD1 mRNA相对表达量随染毒浓度和染毒时间增加而降低（P<0.05），Axin、Wnt5a mRNA相对表达量随染毒浓度和染毒时间增加而表达增高（P<0.05）。7．β-catenin、C-myc、CyclinD1蛋白表达随染毒浓度和染毒时间增加而降低（P<0.05），Axin、Wnt5a蛋白表达随染毒浓度和染毒时间增加而升高（P<0.05）。8．β-catenin siRNA转染30.00μmol/L的NaAsO2染毒后的HELF细胞，早期凋亡率高于 Control siRNA转染组和空白对照组（P<0.05）。9．?-catenin siRNA转染后：β-catenin、C-myc、CyclinD1无蛋白表达，Axin蛋白表达无明显变化（P>0.05），Wnt5a蛋白表达随染毒时间增加而增加（P<0.05）。10．β-catenin siRNA转染后，β-catenin mRNA几乎不表达，Wnt5a mRNA相对表达量随染毒时间延长而增加（P<0.05）。
　　结论：
　　1．NaAsO2可致HELF细胞微结构改变。
　　2．NaAsO2可导致HELF细胞氧化损伤，抑制细胞增殖活性，诱导细胞凋亡。
　　3．NaAsO2可致HELF细胞内Wnt信号通路负性调节因子Axin和Wnt5a基因表达升高，Wnt/β-catenin通路上游核心基因?-catenin，下游靶基因C-myc、CyclinD1表达降低，说明砷对Wnt/β-catenin信号通路的抑制可能是引起细胞增殖抑制，氧化应激，凋亡增加的分子机制之一。
　　4．转染β-catenin siRNA，特异性抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，可加重砷致HELF细胞的凋亡，使β-catenin、C-myc、CyclinD1基因表达缺失，而该通路负性调节因子Wnt5a表达升高，进一步说明砷对Wnt/β-catenin信号通路的抑制是砷致HELF细胞损伤重要机制之一。