无机砷对大鼠HSC纤维化改变及DNMTs表达的实验观察

摘要

目的：研究不同剂量无机砷刺激大鼠肝星状细胞(HSC)后其纤维化情况，观察在此过程中DNMTs的变化，为进一步阐述无机砷致肝损伤的作用机制提供依据。
　　方法：1.采用MTT还原法检测细胞生长情况和细胞活力；确定LC50和染毒浓度即亚砷酸钠(As3+)低、中、高剂量组和砷酸钠(As5+)低、中、高剂量组。2.流式细胞仪(FCM)检测不同剂量和时间点的大鼠HSC-T6的凋亡情况。3.酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)检测无机砷干预大鼠HSC-T6后的Ⅰ型胶原(COL-1)、Ⅲ型胶原(COL-3)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量。4.通过实时荧光定量(Real-Time Quantitative PCR)检测无机砷干预大鼠HSC-T6后TGF-β1、DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3l的mRNA的表达水平。5.蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot检测无机砷干预大鼠HSC-T6后TGF-β1和DNMT3a在细胞内的蛋白表达。
　　结果：1.无机砷染毒 HSC-T6细胞48h时，测得 As3+的LC50为60.00μmol/L，As5+的LC50为93.00μmol/L，即亚砷酸钠组的低、中、高剂量依次是5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L。砷酸钠组的低、中、高剂量依次是20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L。对照组为0μmol/L。细胞的增殖活力随剂量时间升高而降低。2.在24h时，除五价砷低剂量组外其它染毒组的凋亡率都高于对照组(P﹤0.05)；48h和72h时随着染砷浓度的增加，凋亡率逐渐升高(P﹤0.05)。浓度一定时，所有染砷组随着染砷时间的增加凋亡率升高(P﹤0.05)。3.各染砷组的COL-1、COL-3、α-SMA的含量随染砷时间和染砷剂量的增加而升高(P﹤0.05)。4.与对照组相比TGF-β1的mRNA表达水平随染砷剂量的增加而上调(P﹤0.05)；相同浓度随着染砷时间的延长，TGF-β1的mRNA表达水平也在不断的增加(P﹤0.05)。5.在同一时间下，DNMT1的mRNA表达量随染砷浓度的升高而上调(P﹤0.05)；同一浓度下，DNMT1mRNA的表达量随染砷时间递增而下调(P﹤0.05)。6.同一时间下，随三价砷染毒剂量的升高DNMT2mRNA的表达水平呈现为上调(P﹤0.05)，而五价砷染毒剂量的升高DNMT2mRNA的表达水平呈现为下调(P﹤0.05)。同一浓度下，在48h时三价中、高剂量组与五价低、高剂量组DNMT2mRNA的表达水平为上调(P﹤0.05)。7.DNMT3a的mRNA的表达量随染砷剂量的升高在降低(P﹤0.05)，但仍是上调；同一剂量组下，随染毒时间的延长DNMT3a的mRNA表达水平为上调(P﹤0.05)。8.同一时间下，24h时三价砷低剂量组DNMT3b的mRNA是表达上调(P﹤0.05)，其它组都是表达下调(P﹤0.05)；48h时DNMT3b的mRNA在三价砷中剂量组表达下调，但在三价砷高剂量组及五价砷低、高剂量组表达上调(P﹤0.05)。浓度一定的情况下，48h、72h时DNMT3b的mRNA的表达在三价砷中剂量与五价砷中剂量为下调(P﹤0.05)，其余为上调(P﹤0.05)。9.24h时三价砷高剂量组，五价砷中、高剂量组DNMT3l的mRNA表达为上调(P﹤0.05)，48h时三价砷中、高剂量组DNMT3l的mRNA表达为上调(P﹤0.05)。72h时三价砷中剂量组显示为上调(P﹤0.05)。同一浓度下，在48h、72h时的所有染砷组的DNMT3l的mRNA的表达水平除三价中剂量是上调，其它组是下调(P﹤0.05)。10.对无机砷诱导 HSC-T6细胞72h时的各基因做相关分析，TGF-β1mRNA的表达与DNMT2mRNA的表达和DNMT3amRNA的表达呈高度正相关(P﹤0.01)。11.Western Blot检测显示TGF-β1和DNMT3a在细胞内的蛋白表达随时间和浓度的增加而上升。且不同组间和不同时间差异有统计学意义(P﹤0.05)。
　　结论：无机砷刺激大鼠HSC-T6后，会引起细胞的凋亡率升高，增殖活力表现为低浓度促进，高浓度抑制；肝纤维化相关胶原COL-1、COL-3和α-SMA的含量有明显升高，TGF-β1 mRNA和蛋白的表达均升高，提示无机砷刺激HSC-T6后可引起纤维化。纤维化时DNMT1、DNMT3a表现为上调，DNMT2表现为下调，DNMT3l除三价砷中剂量为上调外，其它组都是下调，DNMT3b变化趋势不明显，肝纤维化机制需做进一步研究。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学分析

结果

1 HSC-T6细胞形态学观察

2 HSC-T6细胞生长曲线

3 亚砷酸钠?砷酸钠染毒细胞LC50的测定及分组

4 无机砷对HSC-T6细胞活性的影响

5 无机砷对HSC-T6细胞形态的影响

6 无机砷对HSC-T6细胞早期凋亡率的影响

7 无机砷刺激HSC-T6后COL-1、COL-3、α-SMA含量的变化

8 无机砷刺激 HSC-T6 后 TGF-β1、DNMT1、 DNMT2、DNMT3a、 DNMT3b、 DNMT3l 的mRNA的变化

9 无机砷刺激HSC-T6细胞后TGF-β1、DNMT3a的蛋白表达

讨论

1 无机砷对HSC-T6细胞形态的影响

2 无机砷对HSC-T6细胞凋亡的影响

3 无机砷对HSC-T6细胞的肝纤维化指标：COL-1、COL-3、α-SMA的影响。

4 无机砷对HSC-T6细胞的TGF-β1 mRNA、DNMTs mRNA表达

5 无机砷对HSC-T6细胞的TGF-β1、DNMT3a蛋白表达的影响

小结

致谢

参考文献

综述:无机砷致肝脏损伤的研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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