沉默Keap1基因对Nrf2相关基因表达的影响及在砷皮肤氧化应激损伤中作用

摘要

目的：研究Keap1基因沉默对Nrf2相关基因表达在砷致皮肤细胞毒性中的作用，为砷致皮肤损伤提供理论依据。
　　方法：1.慢病毒载体的构建。依据Keap1基因序列构建Keap1shRNA,采用BamH I，EcoR I双酶切载体,T4ligase连接载体与目的基因，经感受肽细胞转化后，平板挑菌培养，菌液测序。2.慢病毒包装。阳性质粒大量抽提扩增，共转293T细胞，收集病毒上清，测定病毒滴度。3.构建沉默Keap1的HaCaT细胞系。不同的慢病毒载体（空载体、Keap1 shRNA1/2/3）分别感染HaCaT细胞，感染复数（MOI）为5，48小时后，1μg/ml嘌呤霉素筛选稳转株。4.稳转株的鉴定。培养上述经过筛选获得的稳转株，提RNA并定量，通过实时荧光定量(Real-Time Quantitative PCR)检测细胞中Keap1 mRNA表达水平。5.采用MTT还原法检测细胞生长状况，确定LC50及染毒浓度，染毒浓度分别为LC50的1/100、1/50、1/10。6.流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。7.RT-PCR检测细胞中Nrf2、Keap1、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表达水平。8.ELISA试剂盒检测细胞中GSH、HO-1、As3MT蛋白表达水平。
　　结果：1.慢病毒干扰载体构建，经基因测序，显示与目的基因序列完全匹配。2.慢病毒滴度测试结果，为2×108TU/ml。3.建立的Keap1-KD稳转细胞株中sh1最好，其基因的沉默效率为71％,作为后续实验细胞。4.混合砷染毒模型细胞48h的LC50为290.00μmol/L，染毒浓度分别为LC50的1/100为2.90μmol/L，LC50的1/50为5.80μmol/L，LC50的1/10为29.00μmol/L。5.2.90μmol/L混合砷染毒促进细胞增殖，抑制细胞凋亡；随染毒浓度增加（5.80μmol/L-29.00μmol/L）染毒时间（48h、72h)延长增殖水平下降，凋亡率迅速上升。6.低剂量（2.90、5.80μmol/L）短时间（8h、24h）混合砷染毒促进模型细胞中Nrf2、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA的表达，与对照组相比表达上调：高剂量（29μmol/L）长时间（72h）混合砷染毒抑制模型细胞中各基因的表达，与对照组相比表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。7.低剂量（2.90、5.80μmol/L）短时间（24h、48h）混合砷染毒模型细胞能促进As3MT、GSH、HO-1蛋白的表达，随染毒浓度（29μmol/L）增加时间延长（72h），As3MT、GSH、HO-1蛋白的表达量有所下降，但仍远高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：1.混合砷染毒能改变细胞中增殖与凋亡的比率，低剂量促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，高剂量抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。2.混合砷染毒模型细胞，Nrf2高表达，随着染毒时间延长、染毒浓度增加基因有下调趋势，但明显高于未转染组。3.混合砷染毒能使模型细胞中Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表达和As3MT、GSH、HO-1蛋白表达发生改变，随着染毒时间延长、染毒浓度增加基因表达由上调趋势转为下调趋势。4.混合砷对模型细胞的毒性作用受时间和浓度交互作用的影响，可推测砷暴露随着染毒时间的延长，染毒浓度的加大对皮肤细胞的损害越严重。

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前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计分析

4 质量控制

5 实验技术路线

结果

1 Keap1沉默细胞模型的构建

2 砷对正常细胞和模型细胞生长及Nrf2相关基因表达的影响

3 混合砷染毒对正常细胞和模型细胞中As3MT、GSH、HO-1蛋白表达的影响

讨论

1 模型细胞的建立

2 混合砷染毒对模型细胞形态的影响

3 混合砷染毒对模型细胞增殖抑制的影响

4 混合砷染毒对模型细胞凋亡的影响

5 混合砷染毒对模型细胞中Nrf2、Keap1、Bach1基因表达的影响

6 混合砷染毒对模型细胞中ERK、CBP基因表达的影响

7 混合砷染毒对模型细胞中As3MT基因和蛋白表达的影响

8 混合砷染毒对模型细胞中GSH蛋白表达的影响

9 混合砷染毒对模型细胞中HO-1蛋白表达的影响

小结

致谢

参考文献

综述 :Nrf及MAPK信号通路在砷中毒机制的作用研究进展

攻读硕士学位期间发表的学位论文

附件1:基因测序结果

导师评阅表